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biogefart

木虫 (著名写手)

[交流] NcoI和SacI双酶切问题?

请问这两个酶双酶切需要注意什么吗?我有个基因已经构建到了T载体,想连到pET22上,但是用这两个酶双切含基因的T载体和pET22后连了N多次也没有成功。
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闹太套
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liumikewolf

金虫 (小有名气)

难兄难弟啊!
2楼2008-11-12 08:42:54
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ypan

木虫 (著名写手)

不需要这么麻烦!
小弟的实验方法你可以参考一下:
1.在PCR上、下游引物上分别设计Nco I和Sac I酶切位点,并设计好保护碱基
2.PCR反应,并用PCR产物纯化试剂盒纯化,然后双酶切纯化的PCR产物和表达载体,再纯化酶切产物(此时也可以用PCR产物纯化试剂盒纯化)
3.进行连接反应

祝你成功!
3楼2008-11-12 09:49:21
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yelitao1983

银虫 (小有名气)

这两个酶没有什么特殊要求!我怀疑你是连接出的问题而不是酶切!
4楼2008-11-12 14:39:50
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biogate21

铁虫 (正式写手)

连接比例1:6以上试试
5楼2008-11-12 15:43:39
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