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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 退火温度的确定
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legend0463

金虫 (小有名气)

[交流] 退火温度的确定

我的两个引物，一个Tm值是68度，另一个是61度。PCR扩增退火温度多少合适啊？？
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1楼 2008-11-11 14:34:36
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yelitao1983

银虫 (小有名气)
★
司马诸葛(金币+1,VIP+0): 8-11 19:14
PCR退火温度一般比TM低5度，56度你试试
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2楼2008-11-11 18:37:13
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synhily

木虫 (正式写手)
按照我的经验：
1.在http://sky.scnu.edu.cn/life/teac ... que/pcr_counter.htm
上分别输入你的上下游引物，计算退火温度。
2.如果温度相同，就在这个温度下扩增；如果不同，就从中间的温度开始向两边的温度扩增，总有一个温度是最好的。
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3楼2008-11-11 21:34:47
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aiduo8587

银虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★ ★
louyiceng(金币+5,VIP+0):支持新虫参加讨论
一般是60℃，单也有差别，要根据种类确定，但一般相差不大。
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4楼2008-11-12 13:06:15
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proteinwang

铜虫 (正式写手)
在pCR仪上58-65度之间设置上几个梯度，进行一次PCR扩增，然后根据扩增目的条带的情况以及目的条带的含量（即简单通过凝胶成像的亮度判定）即可确定你引物的最佳退火温度。
引物的退火温度有一般的推断，但是还得需要自己的实验验证。
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5楼2008-11-14 10:01:37
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longfeng

金虫 (小有名气)
★
司马诸葛(金币+1,VIP+0): 8-11 19:15
最好是在58度左右扩增，且尽可能要高
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6楼2008-11-14 10:33:21
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