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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 质粒提取不出来，求解决办法
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wnjtmp505
祝福
11楼2016-07-17 18:42:35
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爱如风过3610

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 不会悲伤的鱼 at 2016-07-16 10:32:41
质粒怎么都能提出来的吧，只是是不是你的目的质粒而已，但是每个人操作方法也不同，我觉得你可以一步一步排除原因，首先是你的菌液，先鉴定一下，pcr什么的，确保菌是正确的，然后是摇菌，我们一般认为大肠的生长期 ...

谢谢解答，菌液在接种前跑过pcr，是正确的，然后接到培养基培养过夜后，提不出质粒，od值大概2.2左右，最主要是过夜摇过的菌液有股酸味，很臭，不知道这个是怎么回事，会不会影响，试剂盒也是正确的
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加油加油！！！
12楼2016-07-18 09:19:23
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爱如风过3610

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 曼陀罗的祈祷 at 2016-07-16 10:19:05
我一般都是50ml离心管加15ml培养基，菌液先活化2小时再接种1:100的比例接，然后培养14个小时吧，第二天用试剂盒提质粒，一般都能提出来，你的提不出来是不是传代次数太多，时间久了质粒丢失，之前有没有保存好的质粒 ...

谢谢解答，菌液在接种前跑过pcr，是正确的，然后接到培养基培养过夜后，提不出质粒，od值大概2.2左右，最主要是过夜摇过的菌液有股酸味，很臭，不知道这个是怎么回事，会不会影响，试剂盒也是正确的，时间久了？难道摇8小时就可以？
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加油加油！！！
13楼2016-07-18 09:20:53
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爱如风过3610

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 梅太奇阿拉干 at 2016-07-15 21:38:30
你加抗生素了吗？可能是杂菌污染

抗生素加了的
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加油加油！！！
14楼2016-07-18 09:21:06
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曼陀罗的祈祷

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
13楼: Originally posted by 爱如风过3610 at 2016-07-18 09:20:53
谢谢解答，菌液在接种前跑过pcr，是正确的，然后接到培养基培养过夜后，提不出质粒，od值大概2.2左右，最主要是过夜摇过的菌液有股酸味，很臭，不知道这个是怎么回事，会不会影响，试剂盒也是正确的，时间久了？难 ...

会不会是杂菌污染
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想做个有趣的人，却在逗比的道路上越走越远~
15楼2016-07-18 09:33:59
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不会悲伤的鱼

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 爱如风过3610 at 2016-07-18 09:19:23
谢谢解答，菌液在接种前跑过pcr，是正确的，然后接到培养基培养过夜后，提不出质粒，od值大概2.2左右，最主要是过夜摇过的菌液有股酸味，很臭，不知道这个是怎么回事，会不会影响，试剂盒也是正确的...

你们实验室都是这样还是是你一个人的提不出来？会不会是因为环境或者水源污染了其它细菌或真菌或者噬菌体什么的？

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16楼2016-07-18 09:39:06
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不爱做实验

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
这是以前在网上找到的一些关于提质粒的分析，就转过来你参考吧，顺便感谢整理这些的陌生人：
1、大肠杆菌老化：涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。
2、质粒拷贝数低：使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体。
3、菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。
4、碱裂解不充分：
     使用过多菌体培养液，导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加溶液P1.P2.P3用量。
     对低拷贝数质粒，提取时，可加倍使用溶液P1.P2.P3，可能有助于增加质粒提取量和质量。
5、溶液使用不当：
     溶液P2.P3在温度较低时可能出现浑浊，应置于37℃保温片刻直至溶解为清亮的溶液，才能使用。
6、吸附柱过载：
     不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分多次提取。
     若用富集培养基，例如TB 或2×YT，菌液体积必须减少；
     若质粒或宿主菌是非常高的拷贝数或生长率，则需调整LB培养液体积。
7、 质粒未全部溶解（尤其质粒较大时）：洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。
8、 乙醇残留： 漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体。树脂型试剂盒漂洗后应晾干树脂，再加入洗脱缓冲液。
9、 洗脱液加入位置不正确：
      洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效率。
10、 洗脱液不合适：
      DNA只在低盐溶液中才能被洗脱，如洗脱缓冲液EB (10 mM Tris•Cl, pH 8.5) 或水。
      洗脱效率取决于pH值。最大洗脱效率在pH7.0-8.5间。
      当用水洗脱时确保其pH值在此范围内，如果pH过低可能导致洗脱量低。
      洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至60℃后使用有利于提高洗脱效率。
11、 洗脱体积太小
       洗脱体积对回收率有一定影响。随着洗脱体积的增大回收率增高，但产品浓度降低。
       为了得到较高的回收率可以适当增大洗脱体积。
12、 洗脱时间过短
       洗脱时间对回收率也会有一定影响。洗脱时放置一分钟可达到较好的效果。
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17楼2016-07-18 10:21:22
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梅太奇阿拉干

木虫 (小有名气)
可能摇菌有一点问题，正常新鲜的大肠杆菌是有一些惺臭味，但不是恶臭，菌体是浑浊但是清亮的，不是粘稠有絮壮的，你试试摇三个小时，取一些菌液测一下od，每隔一段时间测一下，直到0.6到0.8为止。然后再严格按照试剂盒要求做，不要着急，多做几次就好了。祝成功

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18楼2016-07-18 14:24:19
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Joyce春春

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by 小冀- at 2016-07-17 14:31:25
提质粒的话我们都是摇将近12个小时的，这应该不是提不出来的原因~如果培养时加抗生素了，保证长出来的菌是转化子，提不出来可能是由于质粒的拷贝数太低~之前我们做谷棒就是这样，一直提不出来，后来才知道是拷贝数只 ...

你好，我用的质粒也是拷贝数比较低，这种情况怎么办呢？
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19楼2016-08-01 17:12:49
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

引用回帖:
19楼: Originally posted by Joyce春春 at 2016-08-01 17:12:49
你好，我用的质粒也是拷贝数比较低，这种情况怎么办呢？...

验证的时候直接pcr鉴定

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···
20楼2016-08-01 18:26:24
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