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求助！IP阴性IgG有条带 已有2人参与
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本人刚做IP，实验步骤如下： 1) 提取脑组织的蛋白原液如上所述，并将蛋白浓度调成5 μg/μl； 2) 向蛋白上清中加入10 μl的兔抗ASC抗体到500 μg总蛋白中，4 ℃缓慢摇匀混合物反应过夜，IgG对照组使用兔源IgG代替兔抗ASC的抗体； 3) 向每支蛋白抗体混合液中加入30 μl protein A琼脂糖珠与抗原抗体复合物反应，4℃缓慢摇匀抗原抗体混合物室温反应4 h； 4) 4℃ 8000 rpm离心2 min，去除上清液，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，用低温的RiPA 裂解液冲洗5遍，300 μl/遍； 5) 向琼脂糖珠-抗原抗体复合物中加入100 μl的2×Loarding Buffer上样缓冲液，轻轻震荡混匀； 6) 95 °C煮沸10 min，4℃ 8000 rpm离心2 min，收集上层液，冷却后可放入-20℃冰箱中保存备用； 我用的ASC是rabbit来源的，阴性对照就用的normal rabbit IgG, 结果检测条带时，孵caspase-1 和ASC，两个泳道都会出现条带，而且阴性的条带更粗，这是怎么回事？ input: ASC(rabbit) normal rabbit IgG  图片1.jpg |
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IgG有条带的话，你可以换一种IgG（其他厂家的），不知道你的IgG用的总蛋白是多少，你可以IgG阴性对照只用1/5的蛋白上清，IgG的量也只用1/5，同时多设几个IgG对照（几个不同公司的IgG），同时IP，选最后检测结果最好的那个。 另外，你的图片和上面标的文字对不上，不知道是哪个有条带哪个没有条带，如果是ASC和IgG都有条带，可能和你洗的条件有关，RIPA裂解液洗5遍可能还是不够，你可以试试250mM的LiCl溶液洗5遍，或者先低盐，再高盐，再LiCl，再TE buffer，LiCl溶液洗5遍更严格。 |
pyhuijie2楼2016-07-14 12:00:07
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3楼2016-07-14 12:05:39
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