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gene121木虫 (著名写手)
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[交流]
【实验】细胞培养问题
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细胞培养问题 1.如何选用培养基？ 培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI- 1640做悬浮细胞培养，各种目的无血清培养的首选是AIM V培养基（SFM）。在开始进行新的细胞培养时，可以参考下表所列的条件： 细胞系 细胞类型 种 组织 推荐使用的培养基 293 成纤维细胞 人 胚胎肾 MEM, 10% 热灭活马血清 3T6 成纤维细胞 小鼠 胚胎 DMEM, 10% 胎牛血清 A549 上皮细胞 人 肺癌 F-12K, 10%胎牛血清 A9 成纤维细胞 小鼠 结缔组织 DMEM, 10%胎牛血清 AtT-20 上皮细胞 小鼠 垂体肿瘤 F-10, 15% 马血清和2.5% 胎牛血清 BALB/3T3 成纤维细胞 小鼠 胚胎 DMEM, 10% 胎牛血清 BHK-21 成纤维细胞 仓鼠 肾 GMEM, 10% 胎牛血清 或MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA BHL-100 上皮细胞 人 乳房 McCoy'5A, 10% 胎牛血清 BT 成纤维细胞 牛 鼻甲骨细胞 MEM, 10% 胎牛血清 和 NEAA Caco-2 上皮细胞 人 结肠腺癌 MEM, 20% 胎牛血清 和NEAA Chang 上皮细胞 人 肝脏 BME, 10% 小牛血清 CHO-K1 上皮细胞 仓鼠 卵巢 F-12, 10% 胎牛血清 Clone 9 上皮细胞 大鼠 肝脏 F-12K, 10% 胎牛血清 Clone M-3 上皮细胞 小鼠 黑素瘤 F-10, 15% 马血清和 2.5% 胎牛血清 COS-1 成纤维细胞 猴 肾 DMEM, 10% 胎牛血清 COS-3 成纤维细胞 猴 肾 DMEM, 10% 胎牛血清 COS-7 成纤维细胞 猴 肾 DMEM, 10% 胎牛血清 CRFK 上皮细胞 猫 肾 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA CV-1 成纤维细胞 猴 肾 MEM, 10% 胎牛血清 D-17 上皮细胞 狗 骨肉瘤 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA Daudi 成淋巴细胞 人 淋巴瘤病人血液 RPMI-1640, 10% 胎牛血清 GH1 上皮细胞 大鼠 垂体肿瘤 F-10, 15% 马血清和 2.5% 胎牛血清 GH3 上皮细胞 大鼠 垂体肿瘤 F-10, 15% 马血清和2.5% 胎牛血清 H9 成淋巴细胞 人 T细胞淋巴瘤 RPMI-1640, 20% 胎牛血清 HaK 上皮细胞 仓鼠 肾 BME, 10% 小牛血清 HCT-15 上皮细胞 人 结肠直肠腺癌 RPMI-1640, 10% 胎牛血清 HeLa 上皮细胞 人 子宫颈癌 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA (in suspension, S-MEM) HEp-2 上皮细胞 人 喉 癌 MEM, 10% 胎牛血清 HL-60 成淋巴细胞 人 早幼粒细胞白血病 RPMI-1640, 20% 胎牛血清 HT-1080 上皮细胞 人 纤维肉瘤 MEM, 10% HI 胎牛血清 和NEAA HT-29 上皮细胞 人 结肠腺癌 McCoy's 5A, 10% 胎牛血清 HUVEC 内皮细胞 人 脐带 F-12K, 10% 胎牛血清 和 肝素盐 100 ug/ ml I-10 上皮细胞 小鼠 睾丸癌 F-10, 15% 马血清和 2.5% 胎牛血清 IM-9 成淋巴细胞 人 骨髓瘤病人骨髓 RPMI-1640, 10% 胎牛血清 JEG-2 上皮细胞 人 绒毛膜癌 MEM, 10% 胎牛血清 Jensen 成纤维细胞 大鼠 肉瘤 McCoy's 5A, 5% 胎牛血清 Jurkat 成淋巴细胞 人 淋巴瘤 RPMI-1640, 10% 胎牛血清 K-562 成淋巴细胞 人 骨髓性的白血病 RPMI-1640, 10% 胎牛血清 KB 上皮细胞 人 口腔癌 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA KG-1 骨髓白细胞 人 红白血病病人骨髓 IMDM, 20% 胎牛血清 L2 上皮细胞 大鼠 肺 F-12K, 10%胎牛血清 L6 大鼠 骨骼肌成肌细胞 DMEM, 10% 胎牛血清 LLC-WRC 256 上皮细胞 大鼠 癌 Medium 199, 5% 马血清 McCoy 成纤维细胞 小鼠 未知 MEM, 10% 胎牛血清 MCF7 上皮细胞 人 乳腺癌 MEM, 10% 胎牛血清 NEAA, 10ug/ml 胰岛素 WEHI-3b 类巨噬细胞 小鼠 骨髓单核细胞白血病 DMEM, 10% 胎牛血清 WI-38 上皮细胞 人 胚胎肺 BME, 10% 胎牛血清 WISH 上皮细胞 人 羊膜 BME, 10% 胎牛血清 WS1 人 胚胎皮肤 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA XC 上皮细胞 大鼠 肉瘤 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA Y-1 上皮细胞 小鼠 肾上腺瘤 F-10, 15% 马血清和 2.5% 胎牛血清 2.为什么要热灭活血清？ 加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在进行免疫学研究、培养ES细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。 3.L－谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？ L－谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L－谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L－谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终确定。L－谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。 4.GlutaMAX-I是什么？培养细胞如何利用GlutaMAX-I？这个二肽有多稳定？ GlutaMAX-I二肽是L－谷氨酰胺的衍生物，将其不稳定的α－氨基用L－丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L－谷氨酰胺供利用。 GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMAX-I二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，L－谷氨酰胺几乎完全降解。 5.为什么培养基中可以省去加酚红？ 酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。 6.如何用台盼兰计数活细胞？ 用无血清培养基把细胞悬液稀释到200－2000个/毫升，在0.1毫升的细胞中加入0.1毫升的0.4％的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色的细胞是死细胞。 7.如何消除组织培养的污染？ 当重要的培养污染时，研究者可能试图消除或控制污染。首先，确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母，把污染细胞与其它细胞系隔离开，用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台，检查HEPA过滤器。 高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性，因而，做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。 1 在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细胞传代的浓度。 2 分散细胞悬液到多孔培养板中，或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内，把选择抗生素加入到每一个孔中。例如，两性霉素B推荐下列浓度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。 3 每天观测细胞毒性指标，如脱落，出现空泡，汇合度下降和变圆。 4 确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度2－3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2－3代。 5 在无抗生素的培养基中培养细胞一代。 6 重复步骤4。 7 在无抗生素的培养基中培养4－6代，确定污染是否以已被消除。 8.培养基中丙酮酸钠的作用是什么？ 丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源。尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。 9.为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀？ GIBICO的胎牛血清 没有预老化，储存在2－8℃时，血清中的各种蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。这应该不会影响血清的质量。推荐在－20℃储存胎牛血清，避免反复冻融。 10.目录上说，Hank’s 平衡盐溶液（HBS）要在空气中使用，不需要CO2培养箱。原因是什么？ Hank’s 平衡盐溶液（HBS）和Earle’s平衡盐溶液（EBS）有什么本质的功能差别？ HBS和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平，碳酸氢钠的含量在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中，溶液会变碱，Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在 CO2培养箱中保存组织，需要用Eagles液。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks液就可以了。 11.Qualified和 Certified 胎牛血清有什么差别? Certified 胎牛血清包括了Qualified 胎牛血清执行的所有的标准检验程序，而且除了这些标准检测，Certified胎牛血清还有如下一些附加的检测： End-Point Determination of Endotoxin Content 噬菌体检验 生物化学检测 激素的检测 血红蛋白检测 Sf9 细胞生长促进及方法学检测 |
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