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ttlovecn铁杆木虫 (正式写手)
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[交流]
求助噬菌体展示技术（100金币）
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本人目前正在做一个课题是关于噬菌体展示的。我想用噬菌体多肽库（Phd-7 phage peptide library）筛选一个与小分子有机化合物结合的多肽受体。由于我以前是做药物化学的，所以对有机合成有细胞培养比较熟悉，但是对噬菌体和细菌的培养比较外行。希望哪位高手可以能帮助我，把实验的细节讲的越详细越好，包括筛选和小分子结合的方法，噬菌体的放大，噬菌体滴度的测定，还有测序问题。如果有人可以给予帮助，我愿意送更多的金币。谢谢！！！！！ [ Last edited by 350784478 on 2009-11-8 at 15:22 ] |
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 噬菌体库筛选 | 实验交流 | 噬菌体展示 | phage display |
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M13 噬菌体的增殖 吸附是噬菌体感染的第一步， M13 噬菌体只感染具有性纤毛的菌株，携带 F 质粒的菌株可产生性纤毛。在吸附过程中，噬菌体的基因 Ⅲ 蛋白与性纤毛发生作用。随后丝状噬菌体穿入到性纤毛，基因 Ⅲ 蛋白与宿主的 TolQ 、TolR 和 TolA 蛋白发生作用，去除外壳蛋白，致使病毒 DNA 及附着于其上的基因 Ⅲ 蛋白进入宿主菌体内。 在宿主细胞内，感染性的单链噬菌体 DNA （正链）在宿主酶的作用下转变成环状双链 DNA ，用于 DNA 的复制，因此这种双链 DNA 称为复制型 DNA （replicative form DNA） ，即 RF DNA 。通过 θ 复制方式， RF DNA 进行扩增，基因的转录也随即开始。基因组中的任意一个启动子都可以启动基因的转录，单方向地终止于下游的终止子。启动子和终止子的位置关系使得靠近终止子的基因转录更频繁。 当基因 Ⅱ 蛋白在亲代 RF DNA 的正链特定位点上产生一个切口时，便启动噬菌体基因组进行滚环复制。此时，在大肠杆菌的 DNA 聚合酶 Ⅰ 的作用下，以负链为模板在切口的 3' 末端加入核苷酸，并持续 DNA 的合成，用新合成的 DNA 替换原有的正链。当复制叉环绕模板整整一周时，被取代的正链由基因 Ⅱ 产物切去，经环化后形成单位长度的噬菌体基因组 DNA 。在感染开始的 15～20 分钟内，这些子代正链在宿主细胞酶的作用下，又转变成 RF DNA ，然后以之为模板继续转录并继续合成子代正链 DNA 。当感染细胞内累计有 100-200 个 RF DNA 时，细胞内也产生了足够的单链 DNA 结合蛋白，即基因 Ⅴ 蛋白。该蛋白可以抑制翻译活性，特别是抑制基因 Ⅱ mRNA 的翻译，并且强烈地结合在新合成的正链 DNA 上，阻止其转化成 RF DNA 。此时， DNA 的合成几乎只产生子代正链 DNA 。另外，基因 Ⅹ 蛋白和基因 Ⅴ 蛋白也是噬菌体特异 DNA 合成的强力抑制子，从而限制感染细胞内 RF DNA 的数量。结果，感染细胞内 RF DNA 的数目和子代正链 DNA 的产生速率都能保持适度。 成熟噬菌体颗粒由 11 个病毒蛋白中的 5 个组成，至少 4 个其他蛋白（如基因 Ⅰ 、Ⅳ 和 Ⅺ 蛋白，以及宿主的硫氧还蛋白（thioredoxin）对噬菌体颗粒的组装和分泌是必须的。 |
8楼2008-11-06 22:42:31
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淘选程序 最简单直接的淘选方法有：直接将靶分子包被于塑材表面（通过非特异的疏水作用或静电相互作用），洗去过量的未吸附分子，然后将噬菌体库覆盖在已包被的靶分子的表面。根据靶分子的不同，直接包被法偶尔会导致配体结合位点难以进入，这或许是由于分子的立体封阻或许是由于靶分子表面的部分变性而引起。在这些情况下，可先将噬菌体库在液相中与靶分子进行预结合，然后将噬菌体-靶分子复合物亲和捕获于链霉亲和素包被的表面（见15页）或其他亲和介质上（见16页）。由于直接包被法相对简单，建议先按以下步骤试用此方法。如果没有淘选到明显的共有结合序列，再进行上述液相结合试验中的一种。 第一天 根据需同时在其上进行文库淘选的靶分子的数量和种类不同，淘选试验可以在单个灭菌聚苯乙烯培养皿、12-或24-孔板、96孔微量板中进行。每种靶分子至少包被一个板（或一个孔）。下述方法中给出的量是60×15 mm培养皿的用量，括号中为微孔板的用量，其他中等尺寸的孔相应地调整此用量。但每种情况下，加入的噬菌体数量都是相同的：2×1011个病毒子。 1. 准备100 μg/ml的靶分子溶液（溶于0.1 M pH 8.6的NaHCO3）。 如果需要稳定靶分子，也可使用其他相似离子强度的缓冲液（含金属离子等）。 2. 每板（孔）加入1.5 ml（微孔板每孔150 μl）上述溶液，反复旋转直到表面完全湿润（小心不要使溶液溅出）。 3. 在增湿容器（如：排列有湿纸巾的可封口塑料盒）中4℃轻微震荡，孵育过夜。平板可在此容器中4℃贮存备用。 第二天 4. 挑ER2738单克隆（噬菌体滴度测定时铺的板）于10 ml LB液体培养基中。如果同一天扩增洗脱的噬菌体，也可将ER2738接种于20 ml LB液体培养基，这时请用250 ml三角瓶（不要用50 ml锥形管）。37℃剧烈震荡培养。 5. 倒掉每板中的包被液，板倒置在干净的纸巾上用力拍甩以除去残余溶液。每板（或孔）加满封阻液，4℃作用至少1 hr。 6. 按5中所述方法除去封阻液。再用TBST (TBS+0.1% [v/v] Tween-20)缓冲液快速洗板6次。每次均旋转以使板或孔的底部及边缘均被洗到，倾去缓冲液，倒置在干净纸巾上拍甩以除去残余溶液（或使用自动洗板机）。此操作要快以避免板干燥。 7. 用1 ml（微孔板则用100 μl）的TBST缓冲液稀释2×1011的噬菌体（即10 μl的原始文库），然后加到已包被好的板上，室温温和摇动10-60 min。 8. 倾倒除去未结合噬菌体，倒置板在干净的纸巾上拍甩除去残余溶液。 9. 按6中所述方法用TBST缓冲液洗板10次，每次换一干净纸巾以避免交叉污染。 10. 根据所研究的分子间相互作用，用1 ml（微孔板则用100 μl）适当的洗脱缓冲液洗脱结合的噬菌体。一般情况下，是将靶分子的已知配体以0.1-1 mM的浓度溶于TBS溶液中或者用游离靶分子溶液（~100 μg/ml溶于TBS中）从固定靶分子上将结合的噬菌体竞争性洗脱下来。室温温和摇动10-60 min，将洗脱液吸入另一干净微量离心管中。 10a.另外，也可用非特异性缓冲液如0.2 M Glycine-HCl (pH 2.2), 1 mg/ml BSA来分离已结合的分子：温和摇动>10 min，洗脱液吸入另一干净微量离心管中。然后再用150 μl（微量孔则用 15 μl）1M Tris-HCl（pH 9.1）中和上述洗脱液。 11. 按上述常规M13方法中的程序测定少量（~1 μl）洗脱物的滴度。如需要，可对第一或第二轮洗脱物滴度测定所得的噬菌斑进行测序，方法见下述。（必要时可将剩余洗脱物4℃贮存过夜，第二天扩增。这时，可将ER2738在LB-Tet培养基中过夜培养，第二天将培养物1:100稀释于20 ml LB中（用250 ml三角瓶盛装），加入未扩增洗脱物。37℃剧烈摇动培养4.5 hr，继续第13步）。 12. 剩余洗脱物应当被扩增：将洗脱物加入到20 ml ER2738培养物中（菌体应当处于对数前期），37℃剧烈摇动培养4.5 hr。 13. 将培养物转入一离心管中，然后，4℃ 10,000 rpm离心10 min。上清液转入另一离心管中，再离心。 14. 将上清的上部80%转入一新鲜管中，加入1/6体积的PEG/NaCl。让噬菌体4℃沉淀至少60 min，最好过夜。 第三天 15. 4℃10,000 rpm离心PEG沉淀15 min。倒掉上清液，再短暂离心，吸去残留上清液。 16. 沉淀物重悬于1 ml TBS中，悬液转入微量离心管中，4℃离心5 min使残余细胞沉淀。 17. 上清转入另一新鲜微量离心管，用1/6体积的PEG/NaCl再沉淀。冰上孵育15-60 min。 4℃离心10 min，弃上清，再短暂离心，用微量移液器吸去残余上清。 18. 沉淀物重悬于200 μl TBS, 0.02% NaN3中。离心1 min，沉淀任何残余的不溶物。上清转入新鲜管中。此即为扩增后的洗脱物。 19. 根据上述常规M13方法用LB/IPTG/Xgal平板滴定扩增后的洗脱物。4℃贮存。 20. 再包被一个板或孔准备第二轮淘选时用，见第8页步骤1-3。 第四和第五天 21. 计数板上蓝斑数确定滴度。用这个值来计算相应于2×1011 pfu的加入量。如果滴度太低，接下来的几轮淘选可用低至109 pfu的噬菌体加入量进行试验。 22. 进行第二轮淘选：用第一轮淘选扩增的洗脱物中2×1011 pfu的噬菌体量重复步骤4-18，在清洗步骤中将Tween的浓度增至0.5% (v/v)。 23. 在LB/IPTG/Xgal平板上测定第二轮淘选所得洗脱物扩增后的滴度。 24. 再包被一个板或孔准备第三轮淘选时用，见第8页步骤1-3。 第六天 25. 进行第三轮淘选：用第二轮淘选扩增的洗脱物中2×1011 pfu的噬菌体量重复步骤4-11，清洗步骤中同样用0.5% (v/v)的Tween。 26. 在LB/IPTG/Xgal平板上测定第三轮淘选所得洗脱物未扩增时的滴度。第三轮洗脱物不必再扩增，滴度测定时得到的噬菌斑可做测序用：只要注意平板培养时间不要超过18小时，培养时间过长容易出现缺失。其余洗脱物4℃贮存。 27. 挑一ER2738单克隆于LB-Tet培养基中培养过夜（不要接种稀释后的铺板培养物）。 |
3楼2008-11-06 22:23:50
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M13 噬菌体载体的宿主菌 由于 M13 噬菌体通过 F 质粒编码的性纤毛进入宿主细胞内，故只能用雄性细菌来增殖病毒。 Messing 及其同事已经构建了许多携带 F' 质粒并便于 M13 载体进行基因操作的多种大肠杆菌菌株，其中最重要的遗传标志有： （1） lacZ D Ml5 lacZ 基因缺失突变体。 （2） D（lac-proAB）lac 基因缺失突变体。 （3） lacIq lacI 基因的突变体。 （4） proAB 细菌染色体上脯氨酸生物合成酶类的编码区域。 （5） traD36 抑制 F' 因子接合转移的突变。 （6） hsdRl7 与 hsdR 4 对大肠杆菌 K 株 Ⅰ 类限制 - 修饰系统失去限制活性但仍保留修饰功能的突变体。 （7） recA1 大肠杆菌重组酶基因。 （8） supE 琥珀抑制基因。 在 M13 噬菌体载体中进行克隆时常用的宿主菌株如下。 JM101 supE D （lac-proAB）[F'traD 36 proAB + lac I q lacZ D M15] JM105 JM101/ hsdR 4 JM107 JM101/ hsdR 17 JM109 JM101/ hsdR 17 recA1 TG1 JM101/ hsd D5（不修饰不限制） XL1-Blue supE lac- hsdR 17 recA1 [F' proAB + lac I q lacZ D M15]Tn 10 （Tet r） |
9楼2008-11-06 22:43:14
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测定噬菌体滴度 只有当噬菌体的感染复度MOI (噬菌体数/细菌数)值远低于1时（即细菌过量时），噬菌斑的数量才会随着加入噬菌体的量而呈线性增加。正因如此，建议检测噬菌体贮液的滴度时，在感染前进行稀释，而不是在高MOI值的情况下稀释被感染的细胞。低MOI值有助于确保每个噬菌斑仅含一个DNA序列。 1. 接种ER2738单菌落于5-10 ml LB培养基中，摇床培养至对数中期（OD600 ~0.5）。 2. 细胞生长时，微波炉融化上层琼脂，分成3 ml等份于灭菌试管中，每个噬菌体稀释度一管。保存于45℃备用。 3. 37℃预温LB/IPTG/Xgal平板，每个噬菌体稀释度取一个平板备用。 4. 在LB中准备10倍系列稀释的噬菌体。 建议稀释范围：扩增的噬菌体培养物上清：108-1011；未扩增的淘选洗脱物：101-104。每个稀释度换一新鲜吸头，建议使用带滤芯吸头以避免交叉污染。 5. 当菌体培养物达对数中期，分成200 μl等份于微量离心管中，每个噬菌体稀释度一管。 6. 每管加入10 μl不同稀释度的噬菌体，快速震荡混匀，室温温育1-5 min。 7. 将感染细胞加入45℃预温的上层琼脂培养管中，每次一管，快速混匀，立即倾注于37℃预温的LB/IPTG/Xgal平板上。适当倾斜平板将上层琼脂均匀铺开。 8. 待平板冷却5 min后，倒置于37℃培养过夜。 9. 检查平板，计数有~102个噬菌斑的平板上的斑数。然后用此数目乘以稀释因子即得到每10 μl噬菌体的空斑形成单位（pfu）滴度。 |
2楼2008-11-06 22:20:47
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噬菌斑的扩增 1. 将ER2738过夜培养物按1:100稀释接种于LB培养基，分1 ml到培养管中。每个要鉴定的克隆一管。一般情况下，由第三轮淘选物中取10个克隆便足以检测结合肽中的共有序列。 2. 用灭菌牙签或吸头，挑一蓝色噬菌斑到上述1 ml培养管中。注意：要从总量不到100个噬菌斑的平板上挑选，以便保证每个被挑的噬菌斑仅含一个DNA序列。 3. 37℃摇床培养4.5-5 hrs（不要过长）。 4. 培养物转入微量离心管中，离心30 sec。上清转入以新鲜管中，再离心。用移液器将80%的上清转入新鲜离心管，此即为扩增噬菌体贮液，可以4℃贮存几个星期而对滴度影响不大。长期贮存应用灭菌甘油1:1稀释后，-20℃贮存。 测序模板的快速纯化(22) 1. 按上述方法进行噬菌斑扩增，在第一步离心后，将500 μl含噬菌体上清转入一新鲜离心管。 2. 加200 μl PEG/NaCl，颠倒混匀，室温放置10 min。 3. 离心10 min，弃上清液。 4. 短暂离心，小心吸去残余上清。 5. 沉淀物彻底重悬于100 μl碘化物缓冲液中，加入250 μl乙醇。室温温育10 min。短时间的室温温育使单链噬菌体DNA沉淀而大多数噬菌体蛋白保持在溶液中。 6. 离心10 min，弃上清。用70%的乙醇洗沉淀，短暂真空干燥。 7. 沉淀重悬于30 μl TE [10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA]中。 8. 5 μl的上述模板溶液足够送测序。用-96 gIII测序引物。 |
4楼2008-11-06 22:27:57
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培养基和溶液： LB培养基： 每升含：10 g Bacto-Tryptone，5 g yeast extract, 5 g NaCl。高压灭菌，室温贮存。 LB/IPTG/Xgal平板： LB培养基 + 15 g/L琼脂粉。高压灭菌，冷却至低于70℃时，加入1 ml IPTG/Xgal*，混匀倒平板。平板4℃避光贮存。 顶层琼脂： 每升含：10 g Bacto-Tryptone，5 g yeast extract, 5 g NaCl, 1 g MgCl2·6H2O, 7 g琼脂粉。高压灭菌，分成50 ml等份。固体培养基室温贮存，用时微波炉融化。 四环素贮液：以20 mg/ml的浓度溶于乙醇中。-20℃避光贮存。用前摇匀。 LB-Tet平板：LB培养基 + 15 g/L琼脂粉。高压灭菌，冷却至低于70℃时，加入1 ml四环素贮液，混匀倒平板。平板4℃避光贮存，如果平板显棕色或黑色请勿用。 封阻缓冲液：0.1 M NaHCO3 (pH 8.6), 5 mg/ml BSA, 0.02% NaN3。过滤除菌，4℃贮存。 TBS: 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl。高压灭菌，室温贮存。 PEG/NaCl: 20% (w/v) PEG-8000, 2.5 M NaCl。高压灭菌，室温贮存。 碘化物缓冲液： 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 4 M NaI。室温避光贮存。 链霉亲和素贮液： 将1.5 mg链霉亲和素冻干粉（本试剂盒提供）溶于1 ml 10 mM磷酸钠(pH7.2)、100 mM NaCl、0.02% NaN3溶液中。4℃或-20℃贮存，避免反复冻融。 *IPTG/Xgal配方：将1.25 g IPTG (isopropyl β–D-thiogalactoside)和1 g Xgal(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside)溶于25 ml二甲基甲酰胺中。溶液-20℃避光贮存。 |
5楼2008-11-06 22:28:28
6楼2008-11-06 22:29:23
7楼2008-11-06 22:41:07
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