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中洪博元：慢病毒使用操作
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1.1 慢病毒技术的原理 慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。在研究RNAi方面，慢病毒技术是最为有效的一种解决方案。 1.2 特点 1） 直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。 2） 可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。 3） 可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。 4） 无需任何转染试剂，操作简便。 5） 可以根据需要制备多种标记。 1.3 慢病毒包装简要流程 1） 含有目的基因的慢病毒RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。 2） 慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。 3） 培养48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。 4） 病毒的纯化和浓缩。 5） 分装、- 80 ℃保存。 6） 滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。 2、慢病毒使用操作手册 2.1 慢病毒的储存与稀释: 2.1.1病毒的储存：收到病毒液后在很短时间内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4 ℃保存；如需长期保存请放置于-80℃（病毒置于冻存管，并使用封口膜封口） 注意事项： A． 病毒可以存放于-80℃ 6个月以上；但如果病毒储存时间超过6个月，我们建议在使用前需要重新滴定病毒滴度； B． 反复冻融会降低病毒滴度：每次冻融会降低病毒滴度10%；因此在病毒使用过程中应仅尽量避免反复冻融，为避免反复冻融建议大家收到病毒后按照每次的使用量进行分装。 2.1.2病毒的稀释：需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后4℃保存(请尽量在三天内用完)分装后使用。 2.2 慢病毒用于体外（In Vitro）实验：感染培养原代细胞和建系 2.2.1慢病毒对各种细胞和组织的亲嗜性：慢病毒对各种细胞和组织的亲嗜性不同，使用慢病毒之前可以通过查阅相关文献，了解慢病毒对您的目的细胞的亲嗜性，感染复数（MOI 值）以及在体外（In Vivo）注射所需要的病毒量。如果没有相关文献支持，可以通过感染预实验得到合适的感染复数（MOI值）（使用24孔板检测病毒对目的细胞的亲嗜性）。 2.2.2慢病毒感染目的细胞预实验 2.2.2.1 慢病毒感染目的细胞预实验注意事项 A． 测定慢病毒对目的细胞的亲嗜性时，需要同时设置对慢病毒亲嗜性较高的细（HEK293T，Hela） 细胞作为平行实验的对照细胞。 B． 在进行慢病毒感染实验时,可以用完全培养基（培养目的细胞用）稀释；理论上，含有血清，双抗或者其他营养因子的完全培养基不影响慢病毒的感染效率。 C．每个公司提供的病毒单位有可能不同，要了解清楚。例如： western Biotechnology提供的病毒单位为TU/ml, 即每毫升中含有具有生物活性的病毒颗粒数。 2.2.2.2 以24孔培养板为例，进行目的细胞和HEK293T 细胞的感染预实验 实验前按照不同的MOI设置不同的感染孔，并根据MOI和细胞数量计算所需要的病毒量，如有必要可以使用PBS溶液或者无血清培养基稀释病毒原液 A. 第一天，准备细胞：在24孔培养板接种若干孔，每个孔内接种3-5X104个目的细胞，铺板时细胞的融合率为50%左右，每孔培养基体积为100 μl；进行病毒感染时细胞的融合度约为70%左右。 B. 第二天，准备病毒：取出4℃保存的病毒，使用台式离心机离心20 秒（使病毒完全悬于离心管底部即可）；如果是冻存在-80℃的病毒需要先在冰上融化后使用。亦可以根据实验室的实际情况将按照MOI准确计算好的慢病毒稀释到培养基中，并尽可能保证所获得的含有慢病毒的培养基的总体积为最小体积，以期获得最佳的感染效率。 第二天，感染目的细胞：病毒准备好之后，从培养箱中拿出细胞，首先观察细胞生长状态，如细胞状态较好则开始实验： a 使用移液器吸取准确体积的病毒液加入准备好的培养基； b 吸去培养基的培养器皿中的培养基（如果细胞生长良好，密度适宜，则不用换液）； c 在目的细胞和对照细胞中分别加入计算好的病毒液； d 混匀后放于二氧化碳培养箱（37℃、5%CO2）孵育过夜。 注意： 感染前细胞的状态好坏对最终的感染效果高低影响很大，所以务必保证加病毒之前细胞处于良好的生长状态； 亦可以将预先准备好的培养基和慢病毒的混合液直接加入培养器皿中； 慢病毒对目的细胞的感染效率较低，通过提高MOI 值可以提高病毒的感染效率，但是当MOI 高于20时，建议大家在培养基中加入ploybrene（8 μg/ml左右）来提高病毒的感染效率。 第三天，更换培养液：一般在24小时候后将含有慢病毒的培养液更换成正常培养液；在感染后观察细胞状态，如果慢病毒对细胞有明显毒性作用而影响细胞生长状态，可以最短在加病毒4小时候更换新鲜培养液后继续培养（建议在8-12小时更换为宜）。第一次换液后，如果慢病毒对细胞没有明显毒性作用，按照正常培养条件培养换液。 第六天，感染效率检测：在倒置荧光显微镜观察荧光，估计慢病毒感染目的细胞的效率； 如果由于目的基因较大而造成选择的载体不能携带Marker Gene的，可以通过QRT-PCR检测目的基因的表达来评估感染效率。 |
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