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用两个pCDNA3.1表达两个蛋白做细胞稳转双转染可行吗
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| 各位丁友，我最近在做一个双转的稳转细胞株，老师跟我说可以用两个pCDNA3.1表达两个蛋白，然后同时转染，因为细胞往往可以同时吸收两个质粒。但是因为我是做稳转细胞株，我担心后面其中一个蛋白会慢慢消失。还有我看到说质粒的不兼容性问题（同种的或亲缘关系相近的两种质粒不能同时稳定地保持在一个细胞内的现象，称为质粒的不相容性）不知道有没有丁友熟悉这个？万分感谢！ |
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新虫 (小有名气)
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- 专业: 临床微生物学检验
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实验需要在真核细胞表达一个DNA病毒的蛋白，但没有特异性的抗体可以用来做WB检测。因此打算用到英杰公司的pcDNA3.1表达载体，载体特性如下： pcDNA™3.1/V5-His TOPO® TA 表达试剂盒 (pcDNA™3.1/V5-His TOPO® TA Expression Kit) 提供一步克隆法，将 Taq 酶扩增的 PCR 产物克隆到高水平表达载体中。 pcDNA3.1/V5-His-TOPO® 载体的拓扑异构酶活化使 PCR 产物仅需 5 分钟即可在实验室完成连接，并产生 90% 的重组体。 另外，该载体还有以下特点： • 具有 CMV 强启动子，实现高水平的组成型表达 • 具有 C 端 V5 表位标签，可使用抗 V5 抗体高效检测重组蛋白 • 具有 C 端多聚组氨酸 (6xHis) 序列，可使用镍螯合树脂进行纯化，用抗 His（C 端）抗体进行检测 载体的部分序列信息如下图： 目的序列经TA克隆插入到上图“PCR Product”处，目的序列C端有V5和多聚组氨酸标签。 现问题如下 1. 在WB检测时打算使用抗V5抗体来检测目的序列是否表达出目的蛋白，不知道是否可行？ 2. 载体的启动子至“PCR Product”之间没有ATG起始密码子，我插入的目的序列是否需要自带ATG密码子？如果需要自带ATG密码子，那么前期PCR扩增目的序列的时候，ATG之前不可避免的会带有几个不相干的碱基序列，是否必须为3的倍数关系(如CCC ATG）？，如果不是3的倍数（如C ATG或CC ATG）会不会影响蛋白的表达起始点？ 3. 插入目的序列是否需要自带终止密码子？如果自带终止密码子，那么会不会导致V5表位和多聚组氨酸无法表达？？ |
2楼2016-06-24 16:44:39