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【热点科普】五分钟看懂CRISPR/Cas技术
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6月2日，Science杂志发表了关于CRISPR技术的突破性成果，确定了一个靶向RNA而非DNA的新型CRISPR系统特征。来自麻省理工学院-哈佛大学Broad研究所、麻省理工学院、美国国立卫生研究院、罗格斯大学新布朗斯维克分校和俄罗斯Skolkovo理工学院的研究人员共同取得了这项研究成果，拥有“CRISPR/Cas之父”之称的著名科学家张锋也是这项研究的主导者之一。这再次让CRISPR技术成为了人们瞩目的焦点. CRISPR/Cas这项明星技术自问世以来，已经吸引了无数欢呼和掌声。在短短两三年之内，它已经成为了生物科学领域最炙手可热的研究工具，并有近700篇相关文献发表。CRISPR/Cas技术的先驱者们，包括张锋以及两位美女科学家珍妮弗·杜德娜和艾曼纽·夏邦杰，更是获得了众多荣誉和奖项。 那么，获得科研人员们如此青睐的CRISPR/Cas技术究竟是什么？它的原理是怎样的？张锋博士的新突破又是什么？本文将带您快速了解CRISPR/Cas技术的原理与应用。 CRISPR/Cas技术是什么？ CRISPR/Cas系统是一种原核生物的免疫系统，用来抵抗外源遗传物质的入侵，比如噬菌体病毒和外源质粒。同时，它为细菌提供了获得性免疫：这与哺乳动物的二次免疫类似，当细菌遭受病毒或者外源质粒入侵时，会产生相应的“记忆”，从而可以抵抗它们的再次入侵。CRISPR/Cas系统可以识别出外源DNA，并将它们切断，沉默外源基因的表达。这与真核生物中RNA干扰（RNAi)的原理是相似的。正是由于这种精确的靶向功能，CRISPR/Cas系统被开发成一种高效的基因编辑工具。在自然界中，CRISPR/Cas系统拥有多种类别，其中CRISPR/Cas9系统是研究最深入，应用最成熟的一种类别。CRISPR/Cas9是继锌指核酸内切酶（ZFN）”、“类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）”之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”。凭借着成本低廉，操作方便，效率高等优点，CRISPR/Cas9迅速风靡全球的实验室，成为了生物科研的有力帮手。在TALEN和ZFN的时代，科学家们往往要花费重金，把基因编辑工作交给生物公司。而现在，在实验室里，人们就可以使用CRISPR/Cas9技术轻松的实现基因编辑。 CRISPR/Cas9如何工作？ CRISPR簇是一个广泛存在于细菌和古生菌基因组中的特殊DNA重复序列家族，充当了防御外源遗传物质的“基因武器”。CRISPR全称Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats—成簇的规律间隔的短回文重复序列，分布在40%的已测序细菌和90%的已测序古细菌当中。图1展示了完整的CRISPR位点的结构。其中，CRISPR序列由众多短而保守的重复序列区（repeat）和间隔区（spacer）组成。重复序列区含有回文序列，可以形成发卡结构。而间隔区比较特殊，它们是被细菌俘获的外源DNA序列。这就相当于细菌免疫系统的“黑名单”，当这些外源遗传物质再次入侵时，CRISPR/Cas系统就会予以精确打击。而在上游的前导区（leader）被认为是CRISPR序列的启动子。另外，在上游还有一个多态性的家族基因，该基因编码的蛋白均可与CRISPR序列区域共同发生作用。因此，该基因被命名为CRISPR关联基因（CRISPR associated，Cas）。目前已经发现了Cas1-Cas10等多种类型的Cas基因。Cas基因与CRISPR序列共同进化，形成了在细菌中高度保守的CRISPR/Cas系统。  图1：CRISPR位点结构图 那么，CRISPR序列是如何与Cas蛋白配合来执行防御功能的呢？整个过程大体分为3步。 1.外源DNA俘获：“黑名单”登记 简单来说，CRISPR/Cas系统在这一步实现了一个“黑名单登记”功能。序CRISPR/Cas系统将识别出入侵者的“名字”（PAM）并找到它的“身份证”（原间隔序列），然后把入侵者身份信息作为“档案”（间隔序列）记录到“黑名单”（CRISPR序列）中。图2展示了第一阶段的工作原理。当噬菌体病毒首次入侵宿主细菌，病毒的双链DNA被注入细胞内部。CRISPR/Cas系统会从这段外源DNA中截取一段序列作为外源DNA的“身份证”，然后将其作为新的间隔序列被整合到基因组的CRISPR序列之中。因此，这段与间隔序列对应的“身份证”被称为原间隔序列（protospacer）。然而，“身份证”的选取并不是随机的。原间隔序列向两端延伸的几个碱基都十分保守，被称为原间隔序列临近基序（protospacer adjacent motif，PAM）。PAM通常由NGG三个碱基构成（N为任意碱基）。病毒入侵时，Cas1和Cas2编码的蛋白将扫描这段外源DNA，并识别出PAM区域，然后将临近PAM的DNA序列作为候选的原间隔序列。随后，Cas1/2蛋白复合物将原间隔序列从外源DNA中剪切下来，并在其他酶的协助下将原间隔序列插入临近CRISPR序列前导区的下游。然后，DNA会进行修复，将打开的双链缺口闭合。这样一来，一段新的间隔序列就被添加到了基因组的CRISPR序列之中。  图2：第一阶段：外源DNA俘获 文章较长，全文请见我的博客：http://blog.sciencenet.cn/u/SciLondon 如有疏漏恳请大家指正，欢迎前来交流！ |
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