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RNA酶保护试验（RPA）
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一、RNA酶保护试验（RPA） RNA酶保护试验（（RNase Protection Assay，RPA）即糖核酸酶保护实验（Ribonuclease protection assay，RPA）是近十年发展起来的一种全新的mRNA定量分析方法。本文主要介绍了核糖核酸酶保护分析实验的从试剂准备到、操作步骤以及实验结果全部的操作流程，供大家分享。 二、材料准备及操作步骤 试剂准备 1. GACU POOL：取100 mM ATP、CTP、GTP各2.78 μl、100 mM UTP 0.06 μl，加DEPC H2O至100 μl。 2. 杂交缓冲液 IPES 0.134 g、0.5 M EDTA（pH8.0）20 μl、5 M NaCl 0.8 ml、甲酰胺8 ml，加DEPC H2O至10 ml。 3. RNase消化液：5 M NaCl 120 μl、1 M Tris-HCl（pH7.4） 20 μl、0.5 M EDTA（pH 8.0）20 μl、RNase A（10 mg/ml） 8 μl、RNase T1（250 U/μl） 1μl，加DEPC H2O至2 ml。 操作步骤 1.反义RNA可由含T7或SP6启动子的重组质粒为模板制备，也可以用含启动子的PCR产物为模板制备，本文介绍后者。 （1）设计含T7启动子的PCR引物 由于PCR产物将作为合成反义RNA的模板，所以一对引物中的下游引物5’-端要含T7启动子序列： T7启动子序列为：5’-TAATACGACTCACTATAGGG 引物设计的其他要求与一般PCR引物的设计相同。PCR产物的长度决定了反义RNA探针的长度，具体设计时可考虑100-400bp长。最好采用巢式PCR，即先扩增出一较长的片段，再以该片段为模板扩增出较短的片段，以保证探针的特异性。 （2）PCR：先用上游引物和下游引物Ⅰ进行PCR，再以PCR 产物为模板，用上游引物和下游引物Ⅱ-T7进行二次PCR。 （3）探针合成标记与纯化 在0.5ml 离心管中加入下列试剂： RNasin （40 U/μl） 0.5 μl GACU POOL GAC （含GTP、CTP、ATP各2.75 mM，UTP 61 μM） 2 μl [α-32P]UTP（10 μCi/μl） 2.5 μl DTT （二硫苏糖醇，0.1 M） 1 μl 5×转录 buffer 2 μl 模板（50 ng/μl） 1 μl T7 RNA 聚合酶 （15 U） 1 μl 混合后，短暂离心，37℃保温1 hr。 加入DNaseⅠ（10 U/μl）1 μl， 37℃ 15 min， 然后75 ℃ 10 min以灭活DNAseⅠ和T7 RNA 聚合酶。 加入：饱和酚 50 μl 氯仿 50 μl 酵母tRNA（2 μg/μl） 4 μl DEPC H2O 100 μl 室温下充分混匀，离心10000 g×2 min。取上层液置另一0.5 ml离心管中，加入100 μl氯仿，混匀，离心10000 g×2 min。将上层液转移至另一0.5 ml 离心管中，再加入3 M NaAc 10 μl、预冷无水乙醇250 μl，混匀后，-20℃静置30 min。4℃离心13500 g×10 min。弃上清液，沉淀用75%乙 醇100 μl洗涤，4℃离心13500 g×2 min， 弃上清液。室温下挥发残留乙醇。加入50 μl杂交缓冲液溶解沉淀，4℃下保存待用。可用尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测探针质量。 2.杂交 （1） RNA提取后溶解在杂交缓冲液中，浓度为1 μg/μl。 （2）取8μl RNA加入1-3 μl探针（根据探针检测结果调整）于0.5 ml 离心管中。 （2） 80℃保温2 min，然后40-45℃下杂交12-18 hr。 3. 消化 （1） 杂交管于37 ℃保温15 min，加入RNase消化液，37 ℃保温30 min。 （2） 加入10%SDS 10 μl、10 μg/μl蛋白酶K 20 μl，混匀，37 ℃保温10 min。 （3） 加入65 μl饱和酚和65 μl氯仿，混匀，室温离心，10000 g×2 min。 （4） 转移上层液到另一0.5离心管中，加入10 μl 酵母tRNA和3 M NaAc 15 μl，再加入200 μl 异丙醇，混匀后，置-20℃ 30 min，4 ℃离心，135000 g×10 min。 （5） 弃上清液，室温下挥发乙醇，加入5-8 μl 上样缓冲液溶解沉淀。 4、电泳与放射自显影 （1）配制凝胶：（50 ml） 40%丙烯酰胺-亚甲双丙烯酰胺（19：1） 6.25 ml 5×TBE 10 ml 尿素 24 g 加H2O至50 ml 溶解后加入25%过硫酸胺50 μl，TEMED 50 μl，混匀，注入电泳槽中，插入梳，待胶凝固。 （2）预电泳 以1×TBE为上下槽电泳缓冲液，加上电压后进行预电泳，如果用测序电泳装置，电压应达2000 v以上，功率设定为100 w，温度设为50℃。待胶板温度达50℃时，暂停电泳，准备加样。 （3）加样 将已溶解在加样缓冲液中的样品80℃加热2 min，立即加样到胶孔中，电泳1-2 hr。（电泳条件同预电泳）。 （4） 电泳结束后，打开胶板，用滤纸取下胶，覆上一层保鲜膜，放置于暗盒中，暗室红光下，压上一张X片，盖上暗盒，-70℃曝光1-3天。暴光结束后，将X光片显影、定影、水洗、晾干。 |
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