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liuanna

新虫 (初入文坛)

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[交流] Real-time qPCR So Easy？

实时荧光定量PCR技术是在定性RCR技术基础上发展起来的核酸定量技术，于1996年由美国Applied biosystems公司推出。是目前确定样本中DNA（或cDNA）拷贝数最敏感、最准确的方法。实时荧光定量PCR法最大的优点是克服了终点PCR法进入平台期或饱和期后定量的较大误差，实现DNA/RNA的精确定量。该技术具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点，所以该技术从产生到现在短短的二十年时间，在科研及检验领域获得了广泛的应用，成为分子生物学领域不可或缺的一项重要技术。
实时荧光定量PCR（Real-time qPCR）是在PCR反应体系中加入一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累积，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA（or cDNA）的起始浓度进行准确定量的方法……什吗？原理您都知道，您有问题，好好好，您先说：
Q1：实时荧光定量PCR主要应用在哪些方面？
A1：实时荧光定量PCR主要应用在以下3个方面：1.DNA或RNA的绝对定量分析。包括病原微生物或病毒含量的检测，转基因动植物转基因拷贝数的检测。2.基因表达差异分析。例如比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异（如药物处理，物理处理，化学处理等），特定基因在不同时期的表达差异以及基因芯片差异结果的验证。3.定性分析。例如SNP检测，基因分型，甲基化检测等等。

Q2：实时荧光定量PCR主要用什么方法？用什么仪器？
A2：主要是Taqman探针法和SYBR Green I法：Taqman探针法特异性比较好，定量比较准确，可做多重PCR，但是探针设计难度高；SYBR Green I法使用方便，成本低，但是对引物的设计要求比较高，不能形成引物二聚体。
仪器为ABI 7500、7900HT，罗氏LC480等，阅微基因采用ABI 7900HT，它是唯一的一款采用激光作为光源的荧光定量机器，灵敏度和准确性高，重复性好，且价格昂贵，是常规7500的2倍，常被用于高端实验。
Q3：荧光定量PCR可以检测哪些基因类型？
A3：可以检测DNA，mRNA，miRNA，LncRNA和环状RNA等。MicroRNA的实时定量PCR（Real-time quantitative PCR）检测运用成熟的实时定量PCR技术准确、快速地定量并检测各种组织、原代细胞及细胞系中目的microRNA的表达情况，具有灵敏度高、实验周期短和特异性高等特点。阅微基因的技术人员通过4年的探索和努力，在miRNA表达检测方面积累了丰富经验，探索出多种有效的实验方法。
Q4：那你们如何选择合适的内参基因呢？
A4：常见的物种做mRNA使用actin做为内参，miRNA检测使用U6做为内参，特殊物种根据文献选择合适的内参。对于一些无法确定内参的物种，我们可以提供内参基因筛选服务，选出稳定的内参用于后续实验。
Q5：荧光定量PCR时需要对样品做标准曲线吗？
A5：常规验证引物扩增效率需要针对每对引物做标准曲线，相对定量的标准曲线样本采用浓度最高的模板作为标准品，绝对定量的标准品为包含待测基因的质粒DNA，标准品需稀释5个不同的稀释梯度，每个稀释梯度10倍，相对定量标准品每个梯度稀释2~5倍。如果引物扩增效率达不到2，用实际的扩增效率进行修正，但不影响变化趋势，如果实验要求不高，也可以不做。
Q6：我做的标准曲线，线性关系不好怎么办？

A6：标准曲线线性关系不佳的原因可能有：1.加样存在误差使得标准品不呈梯度。2.标准品出现降解，应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。3.引物或探针不佳。

Q7：那么扩增曲线中为什么会出现“无Ct值出现”的情况呢？
A7：可能是检测荧光信号的步骤错误：一般SG法采用72°C延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。也有可能是引物、探针或者模板降解。
Q8：我的Ct值是出来了，但是出现的太晚了（Ct>38）是肿么回事？

A8：导致这种现象最可能的原因是扩增效率低，应该优化反应条件，设计更好的引物或探针；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。也有可能是PCR反应各成分不足，或者PCR产物太长，根据阅微基因的经验，一般采用80-150bp的产物长度。
Q9：Ct值看着没问题，可是为什么熔解曲线不只一个峰呢？

A9：可能是引物设计不够优化，先提高退火温度，适当降低镁离子浓度和引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。优化后还是有非特异的峰，需要重新设计特异性引物扩增。
是不是觉得实时荧光定量PCR没那么简单了，阅微基因从事荧光定量服务多年，有丰富的实验经验，通量高，且可以检测低丰度的RNA样本，比如血浆样本、石蜡切片；另外，阅微基因还可以为您提供MicroRNA表达检测，LncRNA、环状RNA的验证等，还等什么，快call我们吧。

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