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siyuansing银虫 (小有名气)
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[交流]
巢式PCR产物无法连接T载体
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连接老手了，这次一段基因很难扩增，不得不用巢式PCR扩增才得到产物，但是连接总是不成功。 先介绍一下巢式PCR以及所用材料： 模板： 基因组（正常，做过阳性对照，基因组OK） 酶：takara的Ex Taq（预混的Taq酶，非高保真，有A尾，以前做过挺多次，都是用这个酶扩增并且连接的） 首先用比目的基因更外部的两个引物进行PCR扩增，扩增完以后直接用产物溶液当模板，进行目的基因的PCR。 扩增出来的产物经跑胶观察，条带位置全部正确。但是做T载体的连接的时候无论如何都连不上，用了不同的T载体不同的连接酶不同的连接条件，该实验现在卡了一个多月。后来把目的基因的引物变长，直接扩增，成功了，并且连上了T载体。现在就是很好奇，为什么巢式PCR的产物连接总是失败呢？请高手多指教。 |
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