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zouzongsheng新虫 (小有名气)
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从基因组上pcr 做梯度出现仍然出现多条带 已有1人参与
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这是从基因组上P 进行验证，设置的梯度 退火温度从48 到62 左边10 个孔是用一对引物P的 目的条带大小655bp 右边十个用的另一对引物 目的条带大小920bp P的是同一个基因 用的2000的Maker 请问还是出现这种情况该怎么优化呢？ |
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2016-06-01 15:26:41, 45.54 K
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用基因组做模板进行pcr，确实会出现非常多非特异性条带，这个很正常，甚至有时候无法避免，那么你需要确定的就是，在某个条件下，你的目的条带的浓度最高，然后通过切胶回收来进行下游的实验。看了一下你的胶图，不知道你的循环数有多少，当然主要是本身引物质量不高，这个可能因为实验需要没办法改变，那么退火温度还可以再高一些，到70度左右都可以的。还有不知道你的模板GC含量如何，需要的话，可以用GC buffer试试。 发自小木虫Android客户端 |
2楼2016-06-01 21:47:55
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你可以检测一下你引物的特异性，通过NCBI网站中的引物blast即可；如果引物特异性很好，那就调节一下你的PCR体系，是否是镁离子浓度太大，镁离子浓度太大的话，会造成非特异性扩增；引物浓度也不能过高，模板浓度也不能过高；再者就是你的PCR程序问题，退火温度适当调节，循环次数降低至20或25试试。 发自小木虫Android客户端 |
5楼2016-06-02 23:46:04
zouzongsheng
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10楼2016-06-04 18:44:43