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新虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 129
帖子: 7
在线: 2.4小时
虫号: 4098319
注册: 2015-09-24
专业: 神经生物学

[求助] 求助！小鼠脑组织石蜡切片染色脱片、烂片已有2人参与

protocol如下：

灌注取脑后，4%多聚甲醛4℃固定24-48h。修块3-4mm。

脱水（常温）：45%、55%、65%、75%、85%、95%、100%酒精各30min；

透明（常温）：（100%酒精+二甲苯）/2  10min，二甲苯①20min，二甲苯②至完全透明（约20min）

浸蜡（60℃）：（二甲苯+石蜡①）/2 10min，石蜡①30min，石蜡②40min；石蜡①为低熔点，石蜡②为高熔点

包埋：浸蜡后用石蜡②手动包埋；

切片厚度：6um、（8um也切的有）

展片：40℃水中展片；

烤片：60摄氏度烤片机侧烤约5min后吸去水分，转移至60℃温箱烤约4h；

脱蜡：烤片后趁蜡未凝固，进行脱蜡。二甲苯 5min×2，100%酒精 3min，95%酒精 2min，

85%酒精    2min，75%酒精    2min，流水冲洗 2min（放在缸子里用水泡的，换了几次水）；

染色：

HE染色：苏木精    5-8min（新配为5min，时间长可为8min，用前过滤），流水冲洗 3min

1%盐酸酒精分化  5s，流水冲洗 1min，0.1%伊红    1-2min，

脱水：85%酒精    2min，95%酒精    2min，100%酒精    2min，

100%无水乙醇：二甲苯（1:1） 2min

透明：二甲苯（I）    3min，二甲苯（II）       3min ；

CV染色：浸入CV染液中    10-20min，

脱水： 75%乙醇    2min， 85%乙醇    2min，95%乙醇    2min，100%无水乙醇    2min，

100%无水乙醇：二甲苯（1:1）    2min

透明：二甲苯（I）    3min，二甲苯（II）    3min；

封片：中性树胶封片（整个染色过程避免干片）。

部分HE染色、CV染色片子结果如图（附件）所示，基本上没有完整的片子（染色时，片子随着在液体里的时间脱片、烂片的程度加深），另CV染色着色浅。

请教论坛大神是什么原因？哪里出了问题，该怎么解决？

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