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新虫 (小有名气)

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[交流] 免疫球蛋白提取技术：IgG的分离与提纯已有5人参与

免疫球蛋白（Immunoglobulin Ig）的含量代表着机体体液免疫的水平，并进一步代表着B细胞的功能，因此测定血清Ig含量可以推知机体的体液免疫功能和诊断某些疾病引起的Ig的过高和过低。
随着免疫学的发展和需要，免疫球蛋白的纯化和其成分的提纯成为必不可少的手段。纯化的方法很多，有单一法，但大多数采用二步法以上相结合的方法，特别是以硫酸铵提纯为基础，再经过层析柱的方法来提高免疫球蛋白及其各成分的纯度最为常用。
硫酸铵溶液能使蛋白质胶体脱水并中和其电荷而使之沉淀下来（称为盐析）。不同浓度的硫酸铵盐析蛋白成分不同，利用这一原理提取所需的免疫球蛋白成分。盐析只能粗提，为了获得纯化的免疫球蛋白成分，必须进一步采用层析的方法进行分离。
免疫球蛋白包括IgG、IgM、IgA、IgE和IgD。

一、 IgG的分离与提纯

（一）材料与试剂配制
1．动物血清
2．硫酸铵饱和溶液
硫酸铵 800g~850g
H2O 1 000ml
加热至绝大部分溶质溶解为止，趁热过滤，置室温过夜，然后以28％NH4OH调pH至7.0（不调pH值也可以）。
注：硫酸铵以质量优者为佳，因次品中含有少量重金属对蛋白质巯基有影响。如次品必须除去重金属，可在溶液中通入H2S，静置过夜后滤过，加热蒸发H2S即可。
3．0.01Mol/L pH7.4PB液
4．1％BaCl 2 溶液
5．纳氏液
HgI 115.00g
KI 80.00g
加H2O至 500.00ml
溶化后过滤，然后再加20％NaOH500.00ml，混合即可。
6．0.50 Mol/L的HCl液和0.50 Mol/L的NaOH液。
7．洗脱液：0.03Mol/L的NaCl液。
8．透析袋（或玻璃纸）。
（二）操作方法
1．取20ml血清，加生理盐水20ml，再逐滴加入(NH 4 ) 2 SO 4 饱和溶液10ml，使成20％(NH 4 ) 2 SO 4 溶液，边加边搅拌，充分混合后，静置30min。
2．3 000r/min离心20min，弃去沉淀，以除去纤维蛋白。
3．在上清液中再加(NH 4 ) 2 SO 4 饱和溶液30ml，使成50％（(NH 4 ) 2 SO 4 溶液，充分混合，静置30min。
4．3 000r/min离心20min，弃上清。
5．于沉淀中加20ml生理盐水，使之溶解，再加(NH4)2SO4饱和溶液10ml，使成33％(NH 4 ) 2 SO 4 溶液，充分混合后，静置30min。
6． 3 000r/min离心20min，弃上清，以除去白蛋白。重复步骤5，2~3次。
7．用10ml生理盐水溶解沉淀，装入透析袋。
8．透析除盐，在常水中透析过夜，再在生理盐水中于4℃透析24h，中间换液数次。
以1％BaCl 2 检查透析液中的SO 4 2- 或以纳氏试剂检查NH 4 + （取3~4ml透析液，加试剂1~2滴，出现砖红色即认为有NH 4 + 存在），直至无 SO 4 2- 或NH 4 + 出现为止。也可采用SephadexG25或电透析除盐。
9．离心去沉淀（去除杂蛋白），上清液即为粗提IgG （即γ球蛋白，如以36％的饱和硫酸铵沉淀血清的产物即为优球蛋白，Euglobin，含γ球蛋白)。
10．过DEAE－纤维素层析柱。（装柱过程见层析技术）。以0.01Mol/L pH7.4PBS（0.03Mol/L NaCl）洗脱，收集洗脱液。
也可采用SephadexG150或G200柱。

[ Last edited by silicare on 2016-5-31 at 17:04 ]

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