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superarm金虫 (正式写手)
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请教SOD提取的方法或文献（金币奖励）
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有谁知道SOD提取的方法，请高人指点了，谢谢！ [ Last edited by 350784478 on 2009-11-8 at 15:27 ] |
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2楼2008-11-02 00:08:04
cdl007
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一.主要设备 1)工业用离心机一台;(2)恒温水浴锅(10L--50L)(可自制)1台;(3)冰柜1台;(4)搅拌机1台;(5)玻璃器皿:1000ml,500ml烧杯各3只,50ml烧杯 2 只,50ml,500ml量杯各1个;(6)塑料桶若干个。 二.主要试剂 工业纯度)柠檬酸钠,柠檬酸,葡萄糖,乙醇90%，氯仿,丙酮,氯化钠,磷酸氢二钠,磷酸二氢钠,去离子水或蒸馏水,葡萄糖凝酸胶SephadexG-- 100 和DEAE--纤维素. 三.试剂的配制: 1.抗凝剂配方 1)柠檬酸钠30g,柠檬酸10g葡萄糖 25g加水至1升,一般此种是每7ml血液,加1ml(抗凝剂).(2)40g/升柠檬酸钠溶液:在1升水中加入0.9克的氯化钠. 2.生理盐水 0.9%)在91克水中加入0.9克的氯化钠. 3.磷酸盐缓冲溶液的配制  H7.6,0.2M磷酸盐缓冲溶液,一般用Na2HPO4.H2O,35. 61 克 / 升和NaH2PO4.2H2O 31.21克/升,前者加87.0ml,后者加13.0ml混合后即为PH=7.6 缓冲溶液,如果用K2HPO4.3H2O为45.644g/升,NaH2PO4.2H2O为31.21克/升,仍是前者87.0ml,后者13.0ml混合后即得. 4.冷却剂:在本工艺中有使用-15度低温,一般用如下配方:用33克食盐加入100克雪或碎冰,以此比例配成混合体可达-21.3度。 四.工艺流程 (一)除血红蛋白 1.血液抗凝处理,在新鲜牛,马,猪血中迅速加入ACD1号抗凝剂,并缓慢搅匀,每7毫升血液中加入抗凝剂1毫升或2号抗凝剂. 2.把抗凝处理的血液放入离心机,以3000r/min离心约15--20分钟, 用吸管把上清液(黄色血清)小心吸去抛掉,下层的红血球用2--3倍生理盐水洗2--3次,在每一次洗涤中,用离心机以3000r/min离心,7--8分钟,反复操作后,得到洗涤血红细胞,洗涤后的血红细胞在-15度下冷冻可保存半年并不影响产率和比活,在血液量大, 处理不完时必须这样做. 3.在洗净的红血球中加入等体积去离子水,剧烈搅拌30分钟,使红血球细胞壁砍碎,以使其内的SOD浸出.最好在0--4度静止过夜后,把溶血进行有机提取. 4.接着向溶血中缓缓加入0.2--0.25倍体积的预冷(-15度)95%乙醇和0.1--0.15倍预冷氯仿,搅拌10--15分钟后,原溶血呈浆糊状,静止1--2小时,用滤布除去凝固的血红蛋白,然后将滤液2500r/min离心约1--5分钟留上清液抛去沉淀, 此时如果上清液略为微黄色时,可用快速过滤纸过滤,可得到微带蓝色的清澈透明的粗酶液 二)粗酶液的初步提纯: 1.丙酮提醇:向酶液中加0.8倍量预冷(-15度 ) 丙酮 , 生成大量白色沉淀 , 以3000r/min离心2分钟收集沉淀,上清液可不必吸取,直接倾倒. 2.热变性 除杂蛋白)准备好衡温浴锅,在本工艺中,提前30分钟, 注满水接通电源后,使之加热到55--60度以省时间,将沉淀量约50倍量体积比加入0.2MPH=7.6磷酸钠缓冲溶液,水浴加热至60度,15分钟后迅速冷却到室温.3000r/min离心2 分钟得上清液,在上清液中,缓缓滴加0.6倍体积的预冷(-15度)丙酮,生成白色沉淀 3.初纯SOD:在上述沉淀中加去离子水,制成20--30%SOD溶液,分装入样品瓶中,放入冷冻干燥机中,于开机后以0.2--0.1Torr真空度,约1.5--2小时, 得到化妆或食品用SOD,该产品比活大于3000u/mg,外观呈微带蓝色的白色冻干品. (三)SOD进一步提纯: SOD精品一般是把SOD产品经过柱层析,柱层析后的SOD没有小分子等杂质, 层析后为高活性的SOD大分子.SOD精品价格更高,它主要作为生物化学试剂, 化验室标准试剂试用.目前SOD柱层析有两种,二者可单独使用,也可结合使用,一般是DEAE-- 纤维素层析和SephadcxG--100葡聚糖凝胶层析,将(二)2,热变性后SOD丙酮沉淀用PH7.6,0.2MNaH2PO4-NaHPO4缓冲溶液溶解,有不溶的杂蛋白时.离心抛去沉淀,上清液上DEAE--纤维素或SephadsxG--100层析柱(1*20cm或2.5*30cm),梯度洗脱 , 洗脱液为PH7.6,0.2M,NaH2PO4--NaHPO4缓冲液,下流速度控制在0.2--0.5ml/min,在分光光度计上用紫外谱325nm处测流出液,合并活力峰,再用蒸馏水反复透析,透析彻底后, 放入样品皿置于冷冻干燥机中干燥后即得SOD精品. 五.注意事项: 1.掌握适当的温度和时间:虽然SOD对热较稳定, 但在分离纯化过程中最好还是采用较低温度,一般以0--10度为宜,时间长不要超过3天. 2.注意提取,提纯方法:使用有机溶剂或者加热均能有效沉淀蛋白质, 但掌握适当溶剂和加热结合的办法可以达到最佳效果 六.SOD的检测方法:活性检验,比较方便的办法是用连笨三酚自氧化法, 先测得连笨三酚的自氧化速率,然后加入SOD再测得加入SOD之后的氧化速率,按照酶活性单位定义,即在最佳条件下,每分钟抑制连笨三酚自氧化分解速率达50% 的酶量定义为一个酶单位.依次求出活力总值 ,同时也可以用聚丙烯酰胺凝胶电泳来测定其纯度,看其分子量32000左右的一条带是否与有关文献指导一致. 超氧化物岐化酶(superoxide dimutase 简称SOD)是一种重要的氧自由基清除剂，作为一种药用酶，引起国内外生化届和医药届的极大关注。SOD应用于医学临床上可以治疗多种疾病，类风湿性关节炎、心肌梗塞等，在防辐射，抗衰老，抗肿瘤等方面也有积极的作用，而且广泛用于化妆品和食品添加剂的行列。 自１９６９年Ｍccord和Ｆridovich 首次发现从牛血细胞中发现超氧化物岐化以来，到目前为止，国内已有几十家科研单位对SOD作了大量的研究和试产工作，而且有些已批量生产。SOD引起了国内生化界的重视，１９８８年在浙江宁波如开了《全国首届SOD学术会议》。1989年4月在河南开封《第三届药用酶学术会议》上，SOD被列为重点开发项目，90年7月在大连《全国第二届SOD学术会议》，SOD已作为一种药用酶发展较快，将成为一种很有前途的生化产物。 SOD是一种广泛存于动物、植物和微生物的生物酶，国外药用SOD系从血中提取，国内SOD已开发的品种已超过２０种，证明我国对SOD的研究和应用已进入新时期。 我国从牛、马、猪、鸡、狗等动物血中提取SOD来源丰富，成本低，提取和纯化较方便，药细胞膜易破，用常规分离纯化法可获得高纯度的SOD。 本技术采用热变性，超滤新技术，不仅大大简化了工艺过程，而且产品质量和收率都比老工艺有较大的提高，其提取的SOD均为ＣuＺu-SOD。 |
3楼2008-11-02 16:27:04
ruoyang3329
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本来想以WORD的形式传上来给你的，看来不行。只能挑几段主要的提取方法复制过来，希望对你有帮助~~~ 目前国内已开发的SOD产品绝大分都是Cu/Zn-SOD，它们最早是从动物的血、肝中分离提取的，主要有以下几个步骤:溶血液的制备、选择性热变性、超滤浓缩、丙酮沉淀、柱层析、冷冻干燥 ［10］ 。但是由于这种方法不可避免地发生一些交叉感染，过敏性反应等现象，开发研究从植物中提取SOD就显得尤为重要。我国近年来在植物SOD的研究领域有大量相关报道。许平 ［11］ 、袁艺 ［12］ 、赵文芝 ［13］ 、余旭亚 ［14］ 等分别从大蒜、桑叶、沙棘、仙人掌中提取SOD并进行了相关研究。其提取方法主要有分步盐析法、有机溶剂沉淀法、层析柱法等。 除了从动植物中提取SOD外，选育SOD高产菌株进行发酵生产也是比较有价值的一种方法。1997年王岁楼等人自然筛选出1株SOD高产菌株Y-216，酶活可达600U/g湿菌 体 ［15］ ，并对其形成SOD的生理条件作了初步研究，为SOD的工业化发酵生产打下了基础。吴思芳等人研究了从啤酒废酵母生产、提取、纯化SOD的方法和条件，得到比活为3048U/mg的SOD酶，指出开展啤酒废酵母生产SOD的综合利用具有经济价值和社会意义 ［16］ 。 由于天然SOD来源有限，且具有异体蛋白免疫原性，外源SOD不易被人体接受等缺陷，使之在应用方面受到很大限制。SOD基因工程是广开酶源，降低成本和获得无抗原性的人源SOD的有效途径。近年来，美、日、英、德相继开发了微生物SOD基因工程产品，并进行了临床实验 ［17］ 。我国医学科学院基础医学研究所和海军总医院分子生物学研究室已成功将人血CuZn-SOD克隆到大肠杆菌中，表达率高达50%。施惠娟等 ［18，19］ 分别以人胎肝组织及人肝细胞株（L02）总RNA为模板，以RT-PCR法获得hCuZn-SOD和hMn-SODcDNA，构建表达质粒pETSOD，并导入E.coli细胞中使之表达。分别获得了38%和50%的高表达率，且表达的SOD有酶活性。鉴于重组的人SOD在体内半衰期仍很短，施惠娟等 ［20］ 又通过基因工程的方法将rhCuZn-SODcDNA基因改造得到了更加稳定的酶。以上说明了我国人源SOD在微生物细胞中的克隆和表达已达到了国际水平。目前，国内外在基因工程生产SOD方面均取得了可喜的成果。 与天然SOD相比，SOD的模拟物有着更显著的优点 ［21］ 。首先是获取和制备比天然SOD要简单得多。天然SOD要从人或其它生物中提取，这就决定了天然SOD的提取必然困难重重，而且产量不高。而模拟SOD可以用化学方法来人工合成，其物质和能量消耗低，且产量不会受到限制。其次，天然SOD作为一种生物大分子，在进入体内时存在着诸如进入细胞能力弱、细胞渗透性差、在血中半衰期短（在人体中SOD只是在很短时间内稳定，其半衰期为分钟级）、不能口服、价格昂贵等缺点 ［22］ 。另外，对于非人体SOD还存在着造成免疫损伤的可能。所以人们把目光投向了SOD模拟物，尤其是低分子量模拟物上。 目前，生物无机化学家们合成和表征了一系列含铜、锰、铁等金属离子的小分子配合物来模拟SOD，期待将来能用小分子模拟化合物代替SOD应用于临床。其中研究最多的含铜络合物是3，5-二异丙基水杨酸铜［Cu（3，5-DIPS）］ ［23］ ，这是一种低分子量的亲脂性络合物，具有天然CuZn-SOD样活性，可以起到抗炎及减轻由链脲菌素诱导产生的糖尿病。刘京萍等 ［24］ 合成的铁（Ⅱ）-酪氨酸模拟SOD金属酶，分子量比天然酶小得多，与天然SOD活性差距较小，且毒性小，从而大大推进了人工合成具有分子质量较小、稳定性高、毒性较底、活性较高等优点的SOD模拟物的研究工作。 但是由于超氧化物歧化酶的模拟属于新型交叉学科，需要化学和生物学知识乃至技术的高度结合，目前的模拟还没有走向成熟，相信随着21世纪化学生物学的崛起，这一新兴交叉学科将会对化学、生物学及医学产生深远的影响。 ［10］王仲礼.从动物血提取SOD［J］.肉类研究，2003，1:42～43. ［11］许平，袁原.大蒜超氧化物歧化酶活性测定及某些性质研究［J］.渝州大学学报（自然科学报），1997，14（1）:43～47. ［12］袁艺，李纯，张小青.桑叶超氧化物歧化酶的提纯和性质研究［J］.安徽农业大学学报，1997，24（3）:296～301. ［13］赵文芝，辛玉华，魏建民，等.沙棘超氧化物歧化酶提纯的研究［J］.内蒙古石油化工，1998，24（2）:31～32. ［14］余旭亚，赵声兰，李[来源:论文天下论文网 lunwentianxia.com] ［15］王岁楼，张平之，张欣，等.酵母SOD形成的生理学研究［J］.工业微生物，1997，27（3）:21～23. ［16］吴思芳，方尚玲，童振球，等.啤酒废酵母提取SOD研究［J］.食品科学，2000，21（3）:22～25. ［17］郭建军.Fe-SOD基因的克隆及其表达研究［D］.浙江大学硕士学位论文，2004. ［18］施惠娟，范立强，魏东芝，等.人铜锌超氧化物歧化酶cDNA的克隆、测序及表达［J］.生物化学与生物物理学报，1999，31（1）:16. ［19］施惠娟，贺华君，魏东芝，等.人Mn-SODcDNA的克隆及高效表达［J］.生物工程学报，2000，16（l）:6. ［20］施惠娟，孙建新，范立强，等.突变的人铜、锌超氧化物歧化酶基因的克隆、测序及表达［J］.中国生化药物杂志，1999，20（3）:109. ［21］丁隽，林骏，陈兰明，等.Mn-SOD模拟物及其在神经退行性疾病中的药用前景［J］.无机化学学报，2001，17（3）:305～309. ［22］Riley D.P.Functional Minics of Superoxide Dismutase Enzymes as Thera-peutic Agents［J］.Chemical Reviews，1999，99（9）:2573～2588. ［23］张龙泽，马书林.SOD模拟化合物的研究进展［J］.药学学报，2002，37（3）:235～240. ［24］刘京萍，李金，葛兴，等.模拟金属酶-铁（II）酪氨酸配合物的合成及SOD样活性［J］.北京联合大学学报（自然科学版），2003，17（3）:40～43. ［25］岳俊杰.镍超氧化物歧化酶模型化合物的设计、合成、表征和构效关系研究［D］.天津师范大学研究生学位论文，2003. |
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