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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » 昆虫细胞裂解得到的上清可不可以直接上离子交换柱？
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ivirus

金虫 (正式写手)

[求助] 昆虫细胞裂解得到的上清可不可以直接上离子交换柱？ 已有2人参与

纯化一个多亚基蛋白，只有一个亚基带了his标签，之前是先过ni柱后，再过离子交换柱，效果不是很好(感觉损失了好多)。我想直接用细胞裂解完离心得到的上清过Q或者S柱，不晓得这样可行吗？会不会应为上清粘度大而堵塞柱子？需要在裂解完的上清中加什么试剂降低粘度或者需要对上清进行透析吗？这该如何是好？还请各位神虫们支招
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奔三的年纪 想换个环境
1楼 2016-05-22 16:08:21
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hc-material

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
ivirus: 金币+18, ★★★★★最佳答案 2016-05-23 20:35:26
上清，过离子柱可以的，裂解时菌和重悬液比例低一些，让裂解液浓度不要太高，然后裂解时加入核酸酶。过柱子前最好在用0.22um的膜过滤下。纯化思路是对的，先离子在亲和，分辨率高的在后面利于纯度提高。祝顺利。
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3楼2016-05-23 09:18:08
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寂寞之巅

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
ivirus: 金币+18, ★★★很有帮助 2016-05-23 20:35:16
也是要超声破碎 打断基因组 加DNaseI 消化，高速离心
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好好学习，天天向上
2楼2016-05-23 08:41:10
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ivirus

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by hc-material at 2016-05-23 09:18:08
上清，过离子柱可以的，裂解时菌和重悬液比例低一些，让裂解液浓度不要太高，然后裂解时加入核酸酶。过柱子前最好在用0.22um的膜过滤下。纯化思路是对的，先离子在亲和，分辨率高的在后面利于纯度提高。祝顺利。

非常感谢您的解惑！我还有一个疑问是：我裂解sf-9细胞是用的是磷酸盐buffer（PH8.0）,可是实验室过离子交换柱都是用的Tris-cl buffer(7.8)。依您看，我需要用这个不含盐的Tris-cl buffer(7.8)作为透析液对细胞裂解液进行透析交换buffer吗？还是用不含盐的磷酸盐buffer（PH8.0）作为透析液？  应为不太清楚这个磷酸盐buffer能不能过离子交换柱...
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奔三的年纪 想换个环境
4楼2016-05-23 20:33:40
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ivirus

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 寂寞之巅 at 2016-05-23 08:41:10
也是要超声破碎 打断基因组 加DNaseI 消化，高速离心

恩 15ml的裂解液，其中加了RNase(10mg/ml)15ul.
                                      DNase(1U/ul) 15ul
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奔三的年纪 想换个环境
5楼2016-05-23 20:35:03
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