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xuewu24588新虫 (小有名气)
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[求助]
WB乙酰化蛋白跑不出，求助
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蛋白提取：用碧云天的RIPA裂解液提取的成骨细胞总蛋白，每mLRIPA加入10uLPMSF，5uM的TSA，10mM的NAM。冰上裂解20min，超声（设置40%pulse，每次5s，间隔3s，10个循环），12000rpm离心5min，取上清。 蛋白电泳：Ac-FoxO1和Ac-p53用10%的胶，Sirt1用6%的胶，80V浓缩胶30min，120V分离胶1 h。 转膜：200mA恒流湿转2 h。 5%脱脂奶（PBST稀释）封闭1 hour，一抗1:1000室温孵育2h，PBST洗3次，每次10min，二抗1:4000室温孵育1h，PBST洗3次，每次10min，PBS洗1次，10min。增强型ECL显影。 抗体来源：Ac-FoxO1购于Santa，Sirt1和Ac-p53购于CST 疑问：1.乙酰化蛋白的WB是不是这样做的？需要注意哪些地方？ 2.Sirt1分子量120kD，WB需要注意什么问题？ 3.Ac-FoxO1和Ac-p53中间的应该不是目的条带吧？  图片1.png |
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