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T细胞尼龙毛分离法
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在研究体内及体外的免疫系统时，分离淋巴细胞群是一个关键步骤。因为现在市场上并没有针对B细胞的特异性抗血清，所以分离淋巴细胞中的T细胞并不是十分方便。T细胞尼龙毛分离法利用了尼龙毛对B细胞的亲和力，从而使T细胞在没有严重损伤的情况下达到的足够的纯度。因为这个方法不像流式和磁珠费用昂贵，而且操作简便，所需要的条件也不高，是一种非常实用的方法。 首先要指出的是实验中所使用的是分离T细胞专用的尼龙毛(Nylon Fiber)，不是化工上的尼龙纤维，曾经有人问过我这种问题，如果你买错了，可是做不出来的！ 现在市面上有尼龙毛填料，也已经有了商品化的尼龙毛柱子，这两者的区别主要是以下两点：1.商品化的柱子的填料量是已经定好的，有一个确定的上样量范围。而自己买填料装柱可以控制填料量，也就是可以控制上样量，这对于样本量非常少，或是样本量非常大的实验需求非常合适。2.商品化的柱子已经经过了无菌处理(一般是辐射灭菌)，而自己装柱当然就要自己灭菌了。 操作方法： 1.秤取1.5g尼龙毛装入20-30ml玻璃或一次性注射器内(要可以灭菌的)，填料的体积控制在15毫升左右(注射器上有标记，所以还是比较好控制的)，因为尼龙毛的松紧关系到T细胞的回收率，所以要特别注意。注射器下端配接5厘米左右长的带有弹簧夹的橡皮管。 2. 加入大量的PBS平衡柱子后，用铝箔包裹，并置于适当的容器内，高压灭菌15分钟。 （商品化尼龙毛柱以上步骤可以省略，经过PBS平衡后可以直接进行下列步骤。） 3. 灭菌的尼龙毛柱垂直固定后放于超净台内，顶部以铝箔覆盖，避免污染。 4. 注射器下端，橡皮管，弹簧夹用无水酒精消毒。打开弹簧夹调节流速在大约3-4ml/min。 5.首先，加入3-4倍柱体的无血培养基平衡随后，之后加入相同体积的含有血清的培养基平衡（上述培养基都要预热），最后等培养基页面接近柱填料页面时，关闭弹簧夹。 6. 样本细胞悬浮液浓度控制在5×108cells/ml的，上样量一般是1/3-1/5柱体积。样品加入之后，再加入少量培养液，然后关闭弹簧夹。 7. 柱上覆盖铝箔，移置于消毒过的容器中，37℃孵育1小时。此过程中柱子必须要保持垂直状态。 8. 从培养箱中拿出柱子，置于超净台内，除去铝箔。接上按照4.中的方法消毒的弹簧夹和橡皮管，加入适当体积经37℃预热的培养基，打开弹簧夹控制流速在3-4 mL/min，流出约5ml之后，流出的培养液基变得不透明，此时其中含有T细胞，收集这一部分培养基。 9. 基本上何时结束收集取决于流出液体中细胞的浓度，实际上，收集的量达到一个柱体积时就可以停止收集，因为即使收集更多的量，回收率几乎不会增加。 10 。上述操作后，细胞的 回收率为： 15 20 ％ T细胞含量： 85 95 ％ B细胞污染率： 1 5 ％ 多数细胞被确定为T细胞。 （注）收集粘附于尼龙毛上的细胞时，将T细胞收集完毕后的尼龙毛再无菌操作的状态下取出，转移到适当的容器中，用镊子小心的将尼龙毛松开，粘附的细胞可以洗到培养基中。或者将注射器芯插入注射器内，通过压力使的粘附的细胞随着液体流出。 品牌 品名 规格 Wako T细胞尼龙毛柱 0.5g*10(推荐用于小鼠脾脏) Wako T细胞尼龙毛柱L型 1g*10 (推荐用于大鼠脾脏、人或兔子的外周血) Wako T细胞尼龙毛 2g*5 (可按照自己的需要装柱，控制上样量) 以上资料参考日本和光纯药的尼龙毛柱产品说明书编写。如要任何问题或需要请联系： 还有更多，欢迎联络！ 上海西宝生物科技有限公司 地址:上海张江高科技园区毕升路299号11-502# 邮编: 201204 电话: 021-5027 2975/76/77/78转6216 联系人：金育华 13817370085 http: //www.cxbio.com E-mail:market@cxbio.com http: //www.cnbio.net ___中国生物网 [search]T细胞 尼龙毛 分离[/search] |
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