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SDS-PAEG 电泳问题
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最近两次做SDS-PAGE 脂蛋白变性电泳 染色使用考马斯亮蓝 但都不见蛋白质条带，很苦恼。 本人不是生物技术出身，请帮帮忙，谢谢了 |
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yang22181
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3楼2008-10-28 09:35:37
yang22181
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脂蛋白有特殊的染色方法，请自行搜索google 第三节 血浆脂蛋白电泳分离定量法 一、血清脂蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳 （一）原理 以聚丙烯酰胺为支持介质，血清脂质用染料预染，使脂蛋白着色，经电泳后，一般可分出三条区带，即β-、前β-、α-脂蛋白。并可用光密度扫描仪检测其相对百分数，乘以总脂量，可求出三种脂蛋白的含量。 （二）试剂与仪器 1．试剂 （1）分离胶缓冲液：三羟甲基氨基甲烷（Tris）18.3g,lmol/L盐酸24ml，加水至100ml(pH8.9) 。 （2）丙烯酰胺Ⅰ液：丙烯酰胺（Acr）15g，甲叉双丙烯酰胺（Bis）0.4g，混匀。 （3）0.35%过硫酸铵（AP） （4）四甲基乙二胺（TEMED） （5）丙烯酰胺Ⅱ液：Acr10g、Bis2.5g、加水至100ml，混匀。 （6）浓缩胶缓冲液：Tris 6g、1mol/L HCl。 （7）0.002%核黄素，48ml，加水至100ml，pH6.7。 （8）电极缓冲液：甘氨酸2.88g、Tris0.6g、加水至1000ml，pH8.3。 （9）1%苏丹黑B染色液：苏丹黑B200mg，丙二醇20ml，水浴加温至溶，离心，去除沉渣，冰箱保存备用。 （10）40%蔗糖水溶液。 2．仪器 电泳仪、光密度扫描仪 （三）操作 1．制胶 （1）先准备清洁的0.5×7.5cm玻璃管，封口底。 （2）配制5%浓度凝胶：取丙烯酰胺Ⅰ液5ml，分离胶缓冲液5ml及Ap液10ml混合，再加TEMED，20μl，混均，用吸管注入每支玻璃管内使胶柱长约4cm，上层用蒸馏水沿管壁仔细加水到凝胶表面，千万别冲散凝胶界面，使凝胶与空气隔绝。静置20～40min，等凝胶凝固后，除去上层水，再加上浓缩胶。 （3）浓缩胶制备：取丙烯酰胺Ⅱ液1.0ml、浓缩胶缓冲液0.5ml、核黄素液0.5ml和水2ml混匀，加TEMED20μl混匀，迅速加入到分离胶上层约1cm高度，沿管壁仔细加蒸馏水覆盖，千万别冲散凝胶界面。置日光灯处聚合30min，也可在强光下聚合，聚合好的浓缩胶呈淡乳白色。凝胶可置4℃冰箱备用。 2．血清预染与加样 在0.25ml血清中加入1%苏丹黑B染色液0.025ml，摇匀，于37℃水溶保温45min。离心除去沉渣，取预染血清30μl，加在聚合好的倾去水层的浓缩胶表面，再加一滴40%蔗糖液，混匀，然后小心地在上面加满电极缓冲液，再装在电泳槽上。 3．电泳 将电极液加入上下电泳槽内，靠样品端的上槽接负极，下槽为正极，接通电源，调节电流为2-5mA/管，30～40min后，关闭电源。 4．剥胶 从电泳槽上取下凝胶管，用带长针头的注射器吸水注入凝胶与玻管内壁之间，使凝胶与玻管内壁分离，再用吸耳球推出凝胶。根据不同型号的光密扫描仪，凝胶扫描或者将装有凝胶的玻管直接扫描定量。 电泳后凝胶一般出现三条区带，从正极到负极依次为α-脂蛋白，β-脂蛋白和前β-脂蛋白，前β-脂蛋白处于浓缩胶和分离胶之间。 5．定量 浆凝胶或连同玻管一道置于光密度计扫描仪上进行扫描，计算每个峰的面积占各峰之和和总面积之比，即为每种脂蛋白组份的百分比。 二、血清脂蛋白琼脂糖电泳法 （一）原理 以琼脂糖凝胶为支持介质，先用脂类染料将血清进行预染，使血清脂蛋白着色，然后电泳。切下各脂蛋白区带，加热溶解，冷却后比色。或者用光密度计直接扫描仪定各区带。计算出α、β-和前β-脂蛋白的相对百分比。 （二）试剂 1．巴比妥HCl缓冲液（pH8.6，离子强度0.075）：称取巴比妥钠15.5g，加入 1mol/LHCl12ml，混匀溶解，加蒸馏水至1000ml，此为电极缓冲液。 2．巴比妥-HCl缓冲液（pH8.6,离子强度0.05）：称取巴比妥钠10.3g,加入 1mol/L HCI8ml，混匀溶解，加蒸馏水至1000ml，用于配琼脂糖凝胶用。 3．0.8%琼脂糖凝胶：取琼脂糖0.8g，溶于配琼脂糖凝胶的缓冲液100ml，置沸水煮溶或置于微波炉中热溶解。 4．1%苏丹黑B的石油醚-乙醇（1：4，V/V）溶液。 （三）操作 1．预染血清：吸血清0.2ml于一小试管中，再加苏丹黑B染色液0.02ml及无水乙醇0.01ml。混匀后置于37℃水溶预染20min。取出各管，2000r/min离心5min，以除去多余的染料。 2．琼脂糖凝胶板制备：将0.8%琼脂糖凝胶溶解后，吸2.5ml到载玻片上，趁热将刻点样槽用有机玻璃盖放在距载玻片一侧近1cm处。一块载玻片前后可打两个槽点两份样品。 3．点样与电泳：取下凝胶上有机玻璃盖并显出一加样小槽。取预染血清40μl，注入此小槽中。在电泳槽内加入巴比妥电极缓冲液，样品端为负极。以四层滤纸或沙布搭桥按10V/cm电泳，待预染血清电泳至最高或40min，切断电源。 4．定量： （1）切割比色法：将凝胶板上各脂蛋色带分别切开置于装入有3ml蒸馏水的试管内。切相应大小的空白琼脂糖放入3ml蒸馏水试管内，为空白管，各管放入沸水煮3min，琼脂糖溶解，待冷，以空白管调零点，于660nm处比色，记录吸光度，以α-、前β-和β-脂蛋白三条区带吸光度总和，比各自区带的吸光度，求其百分比。这种半定量方法不够准确，误差很大。 （2）扫描定量：预染脂蛋白琼脂糖凝胶电泳毕，其琼脂糖凝胶板上有色带，可直接置于光密度扫描仪扫描，并得出各区带的百分比，如果输入该病人的血脂总量，即可算出α-、前β-和β-脂蛋白的各自含量，如图16-2所示。 图16-2 血清脂蛋白电泳（琼脂糖） 正常参考值（百分比）： α-脂蛋白 25.7±4.1% 前β-脂蛋白 21.0±4.4% β-脂蛋白 53.3±5.3% 注意事项：①血清样品要新鲜；②为了免去离心步骤，吸取预染血清时，应吸取上层，下层或管底可能有染料颗粒沉渣，否则应再离心后吸预染血清。 [ Last edited by yang22181 on 2008-10-28 at 09:34 ] |
2楼2008-10-28 09:32:19
