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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR没有条带，同时P的有条带。回答好的，每个追加10金币。
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施子墨

金虫 (正式写手)

[求助] PCR没有条带，同时P的有条带。回答好的，每个追加10金币。 已有2人参与

用的cDNA文库做的PCR。调整退火温度，每条带。产物1200多bp。同时P了其他东西，都有条带，唯独这个没有，很干净，一点条带都没有，
希望能得到帮助~谢谢
CDS区
atgtcag ggcggcccag aaccacctcc tttgcggaga
1021 gctgcaagcc ggtgcagcag ccttcagctt ttggcagcat gaaagttagc agagacaagg
1081 acggcagcaa ggtgacaaca gtggtggcaa ctcctgggca gggtccagac aggccacaag
1141 aagtcagcta tacagacact aaagtgattg gaaatggatc atttggtgtg gtatatcaag
1201 ccaaactttg tgattcagga gaactggtcg ccatcaagaa agtattgcag gacaagagat
1261 ttaagaatcg agagctccag atcatgagaa agctagatca ctgtaacata gtccgattgc
1321 gttatttctt ctactccagt ggtgagaaga aagatgaggt ctatcttaat ctggtgctgg
1381 actatgttcc ggaaacagta tacagagttg ccagacacta tagtcgagcc aaacagacgc
1441 tccctgtgat ttatgtcaag ttgtatatgt atcagctgtt ccgaagttta gcctatatcc
1501 attcctttgg aatctgccat cgggatatta aaccgcagaa cctcttgttg gatcctgata
1561 ctgctgtatt aaaactctgt gactttggaa gtgcaaagca gctggtccga ggagaaccca
1621 atgtttcgta tatctgttct cggtactata gggcaccaga gttgatcttt ggagccactg
1681 attatacctc tagtatagat gtatggtctg ctggctgtgt gttggctgag ctgttactag
1741 gacaaccaat atttccaggg gatagtggtg tggatcagtt ggtagaaata atcaaggtcc
1801 tgggaactcc aacaagggag caaatcagag aaatgaaccc aaactacaca gaatttaaat
1861 tccctcaaat taaggcacat ccttggacta aggtcttccg accccgaact ccaccggagg
1921 caattgcact gtgtagccgt ctgctggagt atacaccaac tgcccgacta acaccactgg
1981 aagcttgtgc acattcattt tttgatgaat tacgggaccc aaatgtcaaa ctaccaaatg
2041 ggcgagacac acctgcactc ttcaacttca ccactcaaga actgtcaagt aatccacctc
2101 tggctaccat ccttattcct cctcatgctc ggattcaagc agctgcttca acccccacaa
2161 atgccacagc agcgtcagat gctaatactg gagaccgtgg acagaccaat aatgctgctt
2221 ctgcatcagc ttccaactcc acctga
设计引物
S- KnpI:          5'  CGGGGTACCATGTCAGGGCGGCCCAGAACC  3'
AS-EcoRI:        5'   CCGGAATTCGGTGGAGTTGGAAGCTGATGC  3'
               
S- KnpI  :           5'  CGGGGTACCATGTCAGGGCGGCCCAGAAC  3'
AS-EcoRI：           5'  CCGGAATTCGGTGGAGTTGGAAGCTGATGCAG  3'
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1楼 2016-04-13 10:36:56
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yangdl1023

木虫 (正式写手)

Panggong
一般碰到这问题，我们就换PRIMER,或换用其它的酶做PCR，一般就可搞定了。如KOD PCR,Dream taq。目前我们也不知这个为什么会这样，但是换primer,enzyme一般都可以搞定
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» 本帖已获得的红花（最新10朵）

施子墨
2楼2016-04-13 13:29:59
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施子墨

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yangdl1023 at 2016-04-13 13:29:59
一般碰到这问题，我们就换PRIMER,或换用其它的酶做PCR，一般就可搞定了。如KOD PCR,Dream taq。目前我们也不知这个为什么会这样，但是换primer,enzyme一般都可以搞定

引物我换了一次不行，我现在考虑换模板试一下。
我们P的别的用这个酶没问题，还用换酶吗？我不懂
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3楼2016-04-13 14:05:12
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施子墨

金虫 (正式写手)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by yangdl1023 at 2016-04-13 13:29:59
一般碰到这问题，我们就换PRIMER,或换用其它的酶做PCR，一般就可搞定了。如KOD PCR,Dream taq。目前我们也不知这个为什么会这样，但是换primer,enzyme一般都可以搞定

我怎么找不到给你金币的选项呢？闹心~送你朵花儿吧
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4楼2016-04-13 14:08:02
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781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
施子墨: 金币+5, ★★★很有帮助 2016-04-13 14:45:28
二聚体都没有吗?你的引物没什么问题呀，就是下游的引物容易在目的片段800处进行扩增，杂带会多一点，退火温度在62-66之间，你不要全序列的话，下游引物可以在重新设计两条试试，你可以在MRNA外设计，不一定要在目的片段里。设计完后，加上酶切在放到总MRNA里看看。
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采菊东篱下，悠然见南山。
5楼2016-04-13 14:18:34
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施子墨

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 781055707 at 2016-04-13 14:18:34
二聚体都没有吗?你的引物没什么问题呀，就是下游的引物容易在目的片段800处进行扩增，杂带会多一点，退火温度在62-66之间，你不要全序列的话，下游引物可以在重新设计两条试试，你可以在MRNA外设计，不一定要在目的 ...

忘了说了，我构建过表达质粒，条带处特别干净，什么都没有。
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6楼2016-04-13 14:45:18
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柳叶刀方恨少

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可以试试Touchdown PCR。
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7楼2016-04-16 09:22:37
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