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高GC模板PCR
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遇到GC含量高的模板很难扩出目的带或者杂带太多。退火温度，引物设计和镁离子浓度的优化足以对大多数模板进行高特异性的扩增，但是，某些模板，包括高GC含量的模板，需要其他的措施。影响DNA熔解温度的添加剂提供了提高产物特异性和产量的另外一种方法。为获得最好的结果需要模板的完全变性。另外，二级结构会阻止引物结合和酶的延伸。PCR添加剂，包括甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱以及PCRx Enhancer Solution可以增强扩增。它们可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区。PCRx Solution还有其他优点。在同Platinum Taq DNA聚合酶和Platinum Pfx DNA聚合酶一起使用时，仅需很少的镁离子优化。这样，将Platinum技术同添加剂结合，增强了特异性，同时减少了第三种方法-镁离子优化的依赖。为获得最佳结果，应优化添加剂的浓度，尤其是会抑制Taq DNA聚合酶的DMSO，甲酰胺和甘油。 1 甘油（5％-10％），甲酰胺（1％-5％）或者DMSO（2％-10％）可以加到高GC含量DNA模板的PCR反应（这些试剂改变了引物模板配对反应的Tm和聚合酶的热稳定性）。 注意DMSO浓度不能太高，否则会使酶失去活性呀。 2 三甲铵乙内酯（0.5-2M）也有助于高GC含量和长DNA的PCR反应。进行滴定以确定最佳浓度。使用三甲铵乙内酯时，降低熔解温度（92-93℃）和退火温度（低1-2℃）。 3 BSA(高达0.8μg/μl)也可以提高PCR反应的效率。 4 PCRX Enhancer Solution (Cat.No. 11495-017)是一种新型的PCR混合溶液，有助于高效扩增富含GC的序列和克服与问题模板PCR相关的困难。 5.LAtag+GC bufferII,并提高退火温度也是个好办法呀。Sample TextSample Text |
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