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[交流]
多糖的离子交换层析
首先,我想说说我的实验背景,我是通过离子交换层析对酸性多糖进行分离的,使用的是0-0.6M NaCl梯度洗脱,流速调的比较低,0.25ml/min左右,每管收集约3ml,洗脱曲线中出来了好几个峰,前面两个小峰,紧接着还有一个峰但相对较大但峰包含有一个左肩峰,这几个峰都连的很紧密,我尝试着降低NaCl的浓度并减小流速,但结果还是类似与一开始的洗脱曲线,因此决定先采取一个低浓度的NaCl阶段洗脱冲柱,在以此浓度-0.6M NaCl范围内梯度洗脱,测绘洗脱曲线,结果显示图中只有包含一个左肩峰的大峰,前图中出现的两小峰均消失.因此决定使用阶段洗脱的方法确定某一低浓度的NaCl先将两小峰及可能含有的杂质去除洗脱下来,接着使用稍高浓度的NaCl将大峰洗脱收集,在这过程中尽可能缩小两个NaCl浓度的范围,但是也尽量保证大峰能完整洗脱下来.
问题就出现在这里,假使我先使用0.15MNaCl冲柱,能够保证将前面的两小峰冲下来了,这时候我逐步增加阶段洗脱时NaCl的浓度,并且苯酚-硫酸法跟踪检测,在我设想中只要我检测中含有糖了,就说明该浓度能将大峰中的糖部分洗脱下来,这一低浓度的NaCl也就可以确定了.关键是在实际操作中,对糖的检测方面,我将分步收集的洗脱液稀释检测,吸光度显示含糖量几乎为0,不稀释检测时,含糖量不低,因为我在洗脱曲线的测绘时,采用的是稀释检测,所以在我的实验设计中只要稀释检测无糖就认为该浓度不能将大峰洗脱下来.可是在后续的实验中又发现不是很可行,因为可能有这种情况:大峰中包含的多糖组分在逐步增加的浓度中分批被洗脱下来,造成样品的稀释,因此可能在某一浓度下大峰被部分洗脱下来了,可由于洗脱量较小,而且我是将洗脱液稀释检测,所以可能检测不到有糖洗脱下来,从而造成假阴结果.关于这个问题考虑了很久仍然没有想到很好的方法解决,希望有这方面经验的高手能够多提意见,不吝赐教,本人不胜感激! |
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