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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 关于双酶切
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zhaoxiag

银虫 (小有名气)

[交流] 关于双酶切

求助：关于双酶切
        最近在构建一个质粒，大小约为7500bp左右，可以用BamH1和Xba1来酶切的，双酶切切出来的条带应该有一条是6500bp，还有一条是1000bp的，可是现在电泳图谱上就只能看见6500bp的那条条带，而1000bp的那条却找不着，另外用BamH1和Xba1来单独酶切时也都能看到7500bp的条带，而且做该质粒的菌液PCR扩增时是能清楚的看到1000bp的条带的。
       我试过先将构建的质粒用Xba1单独酶切后切胶回收用BamH1再酶切，也试过两者同时加入一个反应体系中双酶切（缓冲液是按照混合时的说明来的），但是最后都没有找到那个1000bp的条带。
      很急啊， 请问各位牛人这是怎么回事啊？我该怎么解决呢？在此拜谢了！

[ Last edited by zhaoxiag on 2008-10-21 at 23:04 ]
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1楼 2008-10-21 23:03:02
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syd.zhang

金虫 (小有名气)
★
zhaoxiag(金币+1,VIP+0):谢谢了哦
没有图片，实在不好说
1000bp 的marker清晰不？加大酶切的量
实在不行，可以试试把1000bp条带附近的胶切下来，胶回收后再跑个PCR，看能不能扩出目的条带
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2楼2008-10-22 00:04:14
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zhongdianshi

银虫 (小有名气)
★
zhaoxiag(金币+1,VIP+0):谢谢啦
不知你现在切了多少的质粒，建议切1ug以上，直接双切。如果是要回收1000bp的片段，建议胶的浓度在1%。
引用回帖:
Originally posted by zhaoxiag at 2008-10-21 23:03:
求助：关于双酶切
        最近在构建一个质粒，大小约为7500bp左右，可以用BamH1和Xba1来酶切的，双酶切切出来的条带应该有一条是6500bp，还有一条是1000bp的，可是现在电泳图谱上就只能看见6500bp的那条条带， ...

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3楼2008-10-22 06:55:21
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zhaoxiag

银虫 (小有名气)
1000bp的条带不需要回收的，我只是想验证一下，然后好接着往下做
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4楼2008-10-22 09:48:16
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jerryqpr

木虫 (正式写手)

小猪亲点的老公
★
zhaoxiag(金币+1,VIP+0):谢谢交流
如果要问清楚 最好吧你的胶片拍个照片传上来
顺便说一句 是不是跑胶时间太长 1000的带跑出去了？
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铁杵可以磨成针,木杵只能磨成牙签,有些事情不是努力可以改变的.
5楼2008-10-23 18:40:20
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ningluztt

铜虫 (小有名气)
★ ★ ★
zhaoxiag(金币+3,VIP+0):非常感谢
如果酶切酶问题的话，建议你电泳时，加到酶切产物的上样量。原因如下：
对于酶切后的质粒，片段6500bp与1000bp的摩尔量是相等的，但是质量比却是6.5：1，当你能清楚的看到6500bp的片段时，假设是50ng，那么这时你的1000bp的量连10ng都不到，当然看不到1000bp的条带啦。
所以尝试加大电泳上样量吧。
好运
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6楼2008-10-24 11:30:36
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zhaoxiag

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by ningluztt at 2008-10-24 11:30:
如果酶切酶问题的话，建议你电泳时，加到酶切产物的上样量。原因如下：
对于酶切后的质粒，片段6500bp与1000bp的摩尔量是相等的，但是质量比却是6.5：1，当你能清楚的看到6500bp的片段时，假设是50ng，那么这时你 ...

非常感谢哦
前几天我狠狠的加大了酶切反应体系中质粒的量，结果看到了1000bp的那条带了，
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7楼2008-10-26 10:49:18
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hihoney

铁杆木虫 (职业作家)
很好的讨论，我也遇到同样的问题。
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8楼2008-10-26 13:22:01
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hihoney

铁杆木虫 (职业作家)
前几天我狠狠的加大了酶切反应体系中质粒的量，结果看到了1000bp的那条带了， [/quote]
加到多大？
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9楼2008-10-27 14:07:12
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wyhredmoon

根本没有连上吧 空载
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10楼2008-10-27 16:22:21
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