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[交流] 【资源】获得真核生物cDNA全长

【资源】获得真核生物cDNA全长
1．获得真核生物cdna全长总的思路
分离基因一般就从中心法则dna、rna、蛋白质的三个层次入手做工作。随生物信息学的发展，电脑克隆基因也称为新兴的技术。从题目获得全长cdna的要求上讲，即使上述几个途径得到的是基因片断，现有的途径也是可以完成cdna全长的获得的（如下图示）。

因此，cdna全长的获得是技术上可以解决的问题，而目的基因的寻找，特别是未知功能的基因的克隆是比较关键的问题，下面就基因克隆的方法做一简要介绍：
2．基因克隆的方法简介
2-1．基因克隆的方法策略选择原则
从表3中可见分离克隆基因基本上有三种类型：即三中不同的条件，可根据欲克隆的目的基因选择条件选择相应的方法。
类型i已知基因的序列
（1）已知dna序列，包括三种情况，一是已知目的基因的dna全部或部分dna序列（与题目要求略有出入）；二是已知其它物种的同类基因的dna序列（功能可能已知，与题目要求略有出入）；三是已知目的基因cdna全部或部分序列（属于题目要求已达到的类型）。
（2）已知目的基因表达产物蛋白等序列。
在这两种情况下一般采用pcr技术或探针分子杂交技术分离克隆目的基因。
 类型ii已有基因图位或标记，转座子等条件，分别可采用转座子标签法、t-dna标签法及图位克隆技术进行分离克隆目的基因。
 类型iii为止目的基因序列
（1）差异表达序列，即目的基因表达具有组织、器官等时空差异性。可以采用随机引物多态性扩增技术，定向引物扩增技术和ddrt-pcr、ssh-pcr、rap-pcr、dna-rda、cdna捕捉法等进行克隆。
（2）无差异表达的目的基因，可采用文库筛选法、功能蛋白分离法即直接测须发等进行，是难度较大较繁琐的策略。
从基因分离克隆的方法进行分类可分为三类：一种类型是功能克隆，即根据已知基因的产物推断出其相应核苷酸序列，再根据此序列合成寡聚核苷酸探针。从cdna文库或基因组文库中调取目的基因。第二种类型是表型克隆。是近年来发展十分迅速的一类方法，例如差异筛选法、差减杂交（sh）、mrna差别显示技术（ddrt-pcr）、代表性差异分析（rad）抑制型差减杂交（ssh）等。第三类是无基因序列及表达功能信息，但具有基因遗传图，转座子标签等条件，常用图位克隆和转座子标签法克隆。
2-2．选择基因分离克隆方法的条件
 若已从一种生物甚至微生物中分离到某个基因，就可以根据此基因的核苷酸序列特点，利用序列克隆法从另一种生物中分离出这个基因，这虽然是一种较快速有效的方法，但该基因的功能可能已知，原创性不强。
 若一个基因所表达的蛋白质能被分离和纯化，则可利用功能克隆法分离这个基因，功能克隆法的主要限制因素是大多数基因的产物至今仍不清楚，即使知道了也需纯化足够的蛋白质或提供氨基酸测序或制备抗体。
 若一种植物的转座子研究的很清楚，或通过转化较容易获得，则可利用转座子标签法分离此基因。尽管利用转座子标签法已分离了不少基因，由于可供利用的转座子种类太少，转座子的转化并非易事，且在不同植物间转座频率差异很大，目前的应用主要局限于拟南芥、玉米等。
 若想分离控制缺失突变体表现型的基因，则可利用消减杂交法。消减杂交法是在微生物研究领域发展起来的，在植物中应用此法首先通过诱变等手段获得确实突变体，应用范围较狭窄，同时消减杂交步骤繁琐且费时费工。若从突变体库中筛出突变体，在满足图为克隆的条件下还可以用图位克隆（见下）。
 若要分离的基因已被定位在分子连锁图上，且离分子标记足够近，则可利用图谱分离法分离该基因。图谱分离法已成功应用于许多基因的分离。但首先应采用各种方法对目标基因（包括前述突变基因）进行定位，在结合染色体步移和筛选yac文库等才能分离基因，因而难度大、时间长、花费大。
 若要分离差异表达的基因，则可利用cdna-rapd、dd-pcr、rd和ssh等差异表达分析法。其中dd-pcr是应用最广泛的一种，并已分离了许多基因或cdna片段，其不足之处主要是高的假阳性率和短小的差别显示片段。高的假阳性率可以通过各种手段排除，差异显示的片段较短问题显得较突出。ddrt-pcr使用了锚定引物t12mn，许多差异显示的条带仅显示了3’端非转录序列，即3’-utr序列，因而用差异片段筛选cdna文库可能筛选不到目的基因。相反，cdna-rapd则可对整个cdna进行差异鉴定，显示的差异条带较长，且包含编码区的可能性大大提高；尽管rapd的重复性有待改进，但通过优化反应参数和扩增条件，其重复性则可以保证；若改用cdna-aflp，则可以完全克服这一缺点。rda是在差减杂交和ddrt基础上发展起来的，它避开了差减法杂交的复杂操作过程，简化了操作程序，同时pcr引物较长，复性和延伸均在72℃进行，排除了dna的非特异形扩增。因而具有重复性好的优点。ssh是以抑制pcr位基础的差减杂交法，它通过2次杂交和2次pcr，保证了该方法具有较好的重复性，且在监测灵敏度上优于cdna-rapc、dd-rt和rda。cdna-rapd和dd-pcr可同时检测两个或两个以上的样品，操作简便，且所需的rna两很少，而pda和ssh则只能检测两个样品，操作较繁琐，且需要的起始材料较多。
 若要分离生物体包含的多数基因，就要进行dna的全序列测定，在通过计算机分析找出分布在dna两条链上所有可能的可读框（orf），最终达到分离任意基因的目的。
2-3．各种基因分离克隆的方法概述
2-3-1．基因芯片技术分离目的基因
生物芯片是高密度固定在固相支持介质上的生物信息分子的微列阵。列阵中每个分子的序列及位置都是已知的，并按预先设定好的顺序点阵。基因芯片是生物芯片的一种，其上固定的是核算类物质，主要用于dna、rna分析。分为dna芯片和微点阵两种。
分离目的基因是是指从基因组中发现或找出某个目的（标）基因。目前是通过①比较不同物种之间，或同一物种不同个体之间；或同一个体在不同生长发育是期或不同环境条件下基因差异表达（基因表达平行分析）来实现的。采用基因芯片技术进行基因差异表达研究可以通过杂交直接检测到细胞中mrna的种类及丰度，与传统的差异显示相比具有样品用量小，自动化程度高，被检测目标dna密度大及并行种类多等优点。②利用同源探针从cdna或est微列阵中筛选分离目的基因。目前有dna芯片、cdna芯片两种。其基本步骤包括：基因芯片的制备、靶样品制备、杂交与检测、目的基因得分离并获得全长。
2-3-2．基因文库技术分离目的基因
基因文库指某一生物类型全部基因的集合。这种集合是以重组体的形式出现。某生物dna片段群体与载体分子重组，重组后转化宿主细胞，转化细胞在选择培养基上生长出的单个菌落（或噬菌斑，或成活细胞）即为一个dna片段的克隆。全部dna片段克隆的集合体即为该生物的基因文库。其类型很多，如可分为基因组文库与cdna文库、克隆文库与表达文库，按载体分有智力文库、噬菌体文库、黏粒载体文库、人工染色体文库等。基因文库构建后，从文库中筛选基因的方法主要有以下几种：核算杂交法、免疫学检测法、dna同胞选择法、pcr筛选法等。基因文库的构建是目前基因工程的核心工作，也是分离目的进的常用方法之一。
2-3-3．功能蛋白组分离目的基因
蛋白组是指细胞内全部蛋白的存在及活动方式，即基因组表达产生的总蛋白质的统称。功能蛋白质组指那些可能涉及到特定功能机理的蛋白质群体。主要研究方法为蛋白质双向电泳。通过高效液相色谱、质普对蛋白质序列进行分析，在借用分子生物学的手段则可以进行目的基因的分离。如：应用pcr进行分离目的基因：通过对蛋白质的序列分析，可以通过密码子的简并性设计简并引物，可利用rt-pcr得到目的基因的全长；应用核算杂交筛选法分离目的基因：即利用简并寡核苷酸探针筛选cdna或基因组文库；免疫雪筛选法分离目的基因：是通过蛋白的特异抗体与目的蛋白的专一结合，从表达文库中分离目的基因的蛋白基因。
2-3-4．pcr技术在基因克隆中的应用
pcr技术已经渗透到生物学的各个领域，在分子克隆和获得cdna全长方面起着重要的作用。利用pcr技术对特定条件下基因的表达进行检测即通过mrna差别显示（ddrt-pcr）可鉴定和分离出所需的目的基因；通过rt-pcr克隆到目的基因的cdna区域进行cdna文库的构建，通过锚定pcr或反向pcr可快速克隆到cdna末端未知序列、功能基因调控区等。现在可用于基因分离和克隆的pcr方法主要有：rt-pcr，ddrt-pcr，用于cdna末端快速克隆的race（第3小节），用于dna序列克隆的panhankle-pcr、cassette-pcr以及减法cdna文库的pcr法构建等。panhankle-pcr、cassette-pcr为基因组已知dna相临未知序列的克隆奠定了良好的基础。
2-3-5．mrna差别显示技术分离差别表达基因
mrna差异显示技术是对组织特异性表达基因进行分离的一种快速行之有效的方法之一。它是将mrna反转录与pcr技术结合发展起来的一种rna指纹图谱技术。它利用5’锚定引物oligo（dt）12mn和3’端随机引物对总mrna进行pcr扩增，以期得到差异表达的条带。并对其差异显示的条带进行回收、克隆。
2-3-6．插入突变分离克隆目的基因
获得突变体进行未知基因的克隆是常用的方法之一。这里举t-dna标签法和转座子诱变分离克隆目的基因的例子。t-dna标签法是将t-dna在任何感兴趣的基因处产生插入性突变，获得分析该基因功能的对照突变体。它将t-dna左右边界之间携带的外源报告基因片段作为一个选择性的遗传标记，因为插入的序列是已知的，因而对获得的转基因重组突变体就可以通过各种克隆和pcr策略加以研究。倘若将35s强启动子在t-dna整合到宿主基因组后，整合到内原基因的上游，则可以产生异常增加或表达的时空特异性改变而破坏基因的表达的效果。有获得性突变和功能丧失性突变等。转座子标签法是将一株携带有功能性转座系统的植物与遗传上有差异的同种植物杂交，因转座因子插入到某一特定的基因序列而破坏了该基因编码的蛋白，进而导致可见的表性的破坏或改变，这样就可以在产生后代中筛选出新型的突变体。
2-3-7．图位克隆目的基因
图位克隆的原理是根据功能基因在基因组中都有相对较稳定的基因座，在利用分子标记技术对目的基因进行精细定位的基础上，用与目的基因机密连锁得分子标记筛选dna文库，从而构建目的基因区域的物理图谱，在利用此物理图谱通过染色体步移逐步*近目的基因或通过染色体登录的方法最终找到包含该目的基因的克隆，并通过遗传转化实验证实目的基因的功能。
2-3-8．酵母双杂交系统分离克隆基因
酵母双杂交系统体系可以发现蛋白相互作用的蛋白的编码基因。这种方法的用途有：验证已知基因间的相互作用；可以快速发现编码蛋白与蛋白间相互作用的特定区域；通过扫描文库与活化区域的作用可以发现相互所用的蛋白，只需一个质粒就可以直接得到编码蛋白的基因，无需制备抗体和纯化蛋白。操作相对简便、快速，不许经过蛋白纯化即可获得编码基因。
2-3-9．生物信息学在分离克隆基因中的应用
生物信息学是在生命科学的研究中，一计算机为工具对生物信息进行储存、检索、和分析的科学。基因组信息学的首要任务之一就是发现新的基因核心的功能，时发现新基因的重要手段。下举几例：
利用est数据库发现新基因（电脑克隆）：寻找到与克隆有关的est后，用电子cdna文库进行筛选；通过生物信息学软件进行分析和查询，最终获得一个基因的全长cdna。
通过保守区发现和可隆基因：即利用同源蛋白质的保守序列或同源基因火爆后区段进行电子筛选，在进一步拼接、延伸从而获得全长的cdna。
从大规模cdna文库测序的序列中确定新基因：首先确定获得的cdna是否为基因全长cdna，确定是否有典型的orf及3’端及5’端。而后可以通过网上搜索确定是否为新的基因，同源比对在判断是否为新基因，若通过检验则为新的基因。
2-3-10．基因分离克隆的新技术
除上述几种基本的方法外，随着生物技术的发展和传统技术的改良，基因可隆的方法又有许多新的技术出现。如基因表达序类标记分析（sage）；由ddrt-pcr演变而来的代表性差异分析（rda），包括基因组dna（gdna）的rda和cdna的rda；抑制型差减杂交（ssh）——基于反转录的双接头扣除的差异分析；转录活动的dna差减杂交技术（tadsh）、利用限制性片段多态性的cdna-aflp等等。这些技术作为基因分离可隆的方法，较以前的技术都具有一定的优点，又有各自的不尽相同的用途。这里不做每一方法的详述。
3．基于race的获得cdna全长的方法
研究cdna并建立cdna文库可以在短时间内获得大量信息，与研究整个基因组dna相比更加简便和快速，是基因组dna研究不可替代的一部分工作。建立和筛选cdna文库来分离和克隆目的基因的经典方法繁琐切工作量大，并经常出现pcr扩增效率低和特异性差的问题，不易得到完整的全长基因，特别是在基因的５’端。cdna末端快速扩增（race）技术的出现解决了这些难题，它可以从低丰度的转录本中快速扩增cdna的5’和3’末端，是一种简单而有效的方法。即使前述的各方法没能得到cdna的全长，也可以通过此方法达到本题目的要求。
3-1. race原理
race是采用pcr技术有已知的部分cdna顺序来扩增出完整的cdna3’和5’端的方法，又被称为单边pcr和锚定pcr。
3’-race（图1b）的一般过程以oligo（dt）17和或称为锚引物或街头的序列组成的引物qt逆转录mrna得到第一条cdna链，然后用含部分锚引物序列的引物q0与基因特异性引物gsp1进行第一轮扩增得到双链cdna，第二轮扩增则采用内部引物q1和gsp2，以防止产生非特异性扩增产物。
采用同样的原理可以进行5’-race（图1c）。先用基因特异性引物gsp-rt逆转录mrna获得cdna第一条链；然后用末端脱氧核甘酰转移酶和datp在cdna5’端加上poly（a）尾；再使用（1）qt引物合成cdna第二条链；（2）q0和一个在gsp-rt上有的引物gsp1扩增cdna；最后采用内部引物q1和gsp2进行第二轮pcr扩增以提高特异性。
扩增后得到的双链cdna用限制性内切酶酶切和southern杂交分析并克隆，得到5’特异性和3’特异性的cdna文库。从两各又相互重叠顺序的5’和3’race产物中可以获得全长cdna，或者可以分析5’和3’端顺序，合成相应引物扩增出全长cdna。
3-2．传统race的改良
有许多研究者对传统race的方法进行了改良，包括简并引物的使用、随机引物得使用、嗜热逆转录酶的使用和精确度提高等的rt-pcr方法的改进以及使用两个锚定区域相同的引物合成了具有末端重复倒转序列（itr）的cdna链的改进方法。这些改良虽对原有的方法进行了改进，但仍不能改善用tdt加尾的局限性，不少小组又提出了新的race方法。
3-3．新型的race
3-3-1．rna连接酶介导的race
rna连接酶介导的race与传统race的最主要区别在于：在逆转录这一步骤之前锚引物直接加在mrna的5’端，即先用烟草酸焦磷酸酶或β-消除法去除mrna的5’帽子结构，然后在t4rna连接酶的作用下降锚引物接在mrna的5’端，在在基因特异性引物的作用下进行逆转录，使得只有含锚引物结构的cdna片断才会被扩增，得到5’端全长的cdna。
这种以rna连接酶介导的race被称作rlm-race或rl-pcr。除了可以用于获得5’端全长cdna外，这种方法也可用于3’-race，即用连接酶直接把序列已知的锚引物接到总rna或mrna尾上，用5’基因特异性引物和锚引物进行pcr扩增。

3-3-2．oligo-capping法
由于rlm-race方法在一开始阶段并没有严格区分开有无帽结构的mrna，锚引物也会加到许多非全长的mrna的5’端。为了消除这一影响，maruyama和sugano创造了oligo-capping方法，先将所有的mrna都用细菌碱性磷酸酯酶或牛小肠碱性磷酸酯酶处理，进行脱磷酸反应（图2）。这对5’端有帽结构的全长mrna毫无影响，却使得无帽结构的非全长mrna的5’端脱磷酸化成为羟基。这样，由于缺少5’-p，在连接反应中非全长的mrna就不能成为连接酶的底物而与锚引物结合，从而消除了所有产生截短5’端的机制。suzuki等利用此技术建立了人类成神经细胞瘤的全长cdna文库和5’特异性cdna文库。

4．获得cdna全长的其它方法
4-1．载体引物法
kato等将oligo-capping技术进一步改进，省去了其中的pcr步骤。他们构建了一种穿梭载体pka1，将此载体做成载体引物，直接连在mrna的3’端（图3）。用这种引物得到的全长cdna既能在体外表达，又能在哺乳动物细胞中表达，省去了亚克隆的麻烦。
4-2．固相支持法
carninci等用生物素标记mrna的帽结构，逆转录合成cdna第一条链后利用rnase i不水解rna-dna杂合链的特点将单链部分去除，这样非全长的rna-dna杂合链就不含生物素标记。在用亲和素包裹的磁性颗粒作为固相支持物，筛选出全长的cdna第一条链。采用这种方法得到的克隆中有约95%尾全长的cdna，切产量为载体引物法的10-50倍。

5．小结
以上即论述了获得真核生物（未知基因）cdna全长的方法和策略，由于水平、时间有限有些策略和方法可能不太符合题目要求，仅作为例举；有些观点也仅为个人观点，并未寻找出处，可能存在一定的错误，而且相当不全面。但总的思路即为基因克隆是关键步骤，如突变体的获得、寻找未知功能的基因等，获得全长是一种手段，是可以通过技术弥补的。

[ Last edited by heck on 2005-6-30 at 16:29 ]

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1楼2005-06-29 09:31:28

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