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qwbio

新虫 (初入文坛)

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[交流] 【原创/翻译】十字花科特征性代谢物的多克隆抗体表征已有1人参与

【短评】甲磺酰烷基硫代葡萄糖苷（methylsulfinylalky glucosinolate) 的多克隆抗体特征研究

在分子生物学的定量和定性实验中，利用抗体识别小分子物质已经成为一种重要的工具。小分子具有低免疫原效能，但通过偶联载体分子可诱导强烈的免疫反应而产生抗体。根据这一原理，研究者发现了植物生长素、双吲哚生物碱、木脂素、芥子甙和抗坏血酸等植物特异性代谢物的抗体。为了避免这些抗体与其他植物成分产生交叉反应，有必要对其特异性进行详细的特征研究。

硫代葡萄糖苷是十字花科植物的特征之一，由氨基酸衍生的特异性代谢物。它们由一个共同的功能基团（如硫代葡萄糖苷基团）和一个多变的支链组成，该支链取决于前提氨基酸，可能是氨基酸支链的延长，也可能是硫代葡萄糖苷功能基团形成后支链的裁剪。4-甲磺酰丁基硫代葡萄糖苷（4msh) 又称为萝卜硫苷，是花椰菜和拟南芥含量丰富的一种甲硫氨酸衍生的脂肪族硫代葡萄糖苷。它是与减少患癌风险相关的一种重要硫代葡萄糖苷。它与花椰菜的化学预防功效相关，并且存在于拟南芥中，由此成为了热门的研究对象。

最近的研究已经表征了4msb-BSA 偶联物多克隆抗体的特异性和效价，更详细的离体表征采用野生型和生物合成突变型拟南芥的植物提取物来确认甲硫氨酸衍生的脂肪族硫代葡萄糖甘的亚磺酰基支链抗体的特异性。这些抗体是非常有效的分析工具，在不同的研究中都有重要的应用，比如研究植物体中4msb的免疫细胞化学分布和美联免疫吸附分析（ELISA）等。4msb（由丹麦的 C2 bioengineering Aps提供）偶联 BSA 的多克隆抗体由法国的 Gemacbio 公司（http://gemacantibodies.com/）制备。在点印迹分析（dot blot analysis) 中，取10微升的10mM 硫代葡萄糖苷溶液与甲醇活化的 PVDF 膜杂交，风干后用5%脱脂乳 PBS 溶液处理2小时来封闭。经过第一抗体（1：2000稀释）4摄氏度孵育过夜后，杂交膜用 PBS 缓冲液冲洗两次，然后用1：1000稀释比的山羊源抗兔抗体（Thermo Scientific 公司的稳定型HRP 二抗）室温下孵育1小时来进行免疫检测。杂交膜用 PBS 缓冲液冲洗两次。采用高信号值的硬脑膜免疫化学发光底物（Thermo Scientific公司）和“ChemiDoc“免疫成像系统（Bio-Rad 公司）进行信号检测。芥子甙（烯丙基硫代葡萄糖苷）、4-甲基三丁基硫代葡萄糖苷（4mtb)、3-甲硫酰基硫代葡萄糖苷（3msp) 和脱磺基4msb购买自 C2 bioengineering Aps 公司（www.glucosinolates.com/profile.aspx)。

野生型拟南芥、生物合成的无义突变型拟南芥（myb28 myb29 cyp79B2 cyp79 B3, 命名为 qKO）、脂肪族生物合成无义突变型拟南芥（mybmyob8 myb29）和烟草的种子种在含有植物基质（丹麦 Pindstrup Mosebrug A/S 公司）的4厘米小盆中。种子经过2天的4摄氏度冷处理后，放入人工培养箱中。拟南芥的生长环境为16小时光照、20摄氏度、湿度70%和100uE 光密度。烟草的生长环境为16小时光照、24摄氏度、湿度70%和100-120光密度。从成熟开花的无斑点植物上采集3片叶子（约2mg），并加800微升的85%甲醇匀浆。2500xg 离心10分钟后，取上清，用快速真空器定容为约500微升后过滤。只有新鲜叶片制备的提取物才会产生好的信号。点印迹法需要10微升植物提取物，除了第一次采用脱脂乳封闭外，杂交膜还要用0.05%的山羊血清（Sigma-Aldrich 公司）室温孵育1小时。这个额外的封闭步骤是严格优化的结果。

在分布表征4msb-BSA 偶联的多克隆抗体过程中，首先选择一个合适于点印迹分析的杂交膜，确保抗体与纯化的4msb 的反应活性。取10微升的10mM 4msb溶液、4msb-BSA偶联物溶液和10mg/ml 的 BSA 溶液与硝化纤维膜和聚偏二氟乙烯（PVDF）膜杂交。相比于硝化纤维膜，PVDF 膜与硫代葡萄糖苷的杂交效果更好。这可能因为 PVDF 膜有更高的结合能力（150-160ug/cm2) 和更小的孔径（0.2um)，相比于硝化纤维膜（80-100ug/cm2, 0.4um)。抗体与4msb-BSA偶联物和4msb 的反应都能获得好信号，而 BSA 没有检测到杂交反应活性（图1a）。该结果表明，抗体特异性识别4msb 的抗原决定簇而不是偶联的 BSA。抗体识别4msb 的敏感性和检测极限的研究，通过已知浓度的4msb滴定测量抗体，或反之。当用稀释梯度从1:100到1:100,000的抗体识别10mM 的4msb 时，稀释比从1：100直到30,000的抗体都能够检测到信号(图1b)。因此，除非特别说明，后面的分析都采用1：2000稀释比的抗体。在互换的的实验中，浓度从1uM 到10mM 的10微升4msb用1：2000稀释的抗体检测。抗体能够识别的最低浓度为50uM，相当于2微克的4msb（图1c)。当4msb 的浓度低于25uM 时，抗体无法识别。该结果表明，在指定实验条件下，抗体识别4msb具有高灵敏性。

抗体的杂交反应活性通过识别不同的甲硫氨酸衍生的脂肪族硫代葡萄糖苷和其他衍生物来检测，包括4-甲基三丁基硫代葡萄糖苷（4mtb）、2-烯丙基硫代葡萄糖苷（芥子甙）、去硫化4msb（脱磺基4msb）和3-甲磺酰基丙酰基硫代葡萄糖苷（3msp）（图2a）。含有甲硫酰基支链的3msp和4msb 都检测到好的信号，这表明抗体识别甲硫酰基基团，并且与链的长度无关（图2）。脱磺基4msb 和4msb 的信号强度相同，这说明抗体并不识别硫代葡萄糖苷功能基团的磺基部分。4mtb 只能检测到很低的杂交反应活性，它与4msb 在结构上的不同之处在于，含有一个甲基三丁基基团，而不是在丁基支链的末端有一个硫氧化的甲磺酰基基团。芥子甙没有检测到信号，这说明抗体不识别硫代葡萄糖苷功能基团的抗原决定族。总而言之，抗体特异性识别甲磺酰烷基硫代葡萄糖苷末端的甲磺酰基基团。因此，结果表明抗体可能用来检测含有不同长度的甲磺酰烷基支链的硫代葡萄糖苷。

为了进一步确认抗体识别脂肪族硫代葡萄糖苷的特异性，采用野生型拟南芥以及不含脂肪族硫代葡萄糖苷（myb28 myb29)或即不含脂肪酸也不含吲哚硫代葡萄糖苷（qKO）的突变型拟南芥的提取物进行试验。烟草叶片的提取物用来检测非十字花科植物代谢物与抗体的杂交反应活性。野生型拟南芥提取物能够检测到信号，而阴性对照（qKO、myb28 myb29和烟草）都没有信号。该结果确认抗体仅仅检测甲磺酰烷基硫代葡萄糖苷。抗体与植物提取物中的甲硫氨酸亚砜等其它结构类似代谢产物没有杂交反应活性，这与抗体将在植物体中的应用至关重要。

抗体在离体实验中显示出良好的反映效果，这预示着有希望于用来在不同的植物组织中定位硫代葡萄糖苷。早前的一个关于硫代葡萄糖苷亚细胞免疫定位的研究缺乏了对所用抗体的全面性特性研究。而本文研究的抗体结合使用硫代葡萄糖苷缺失突变体作为阴性对照，可以在植物体重免疫定位甲磺酰烷基硫代葡萄糖苷。

简而言之，本文对甲磺酰烷基硫代葡萄糖苷的特异性抗体做了一个详细的离体特征研究。该抗体提供了一个非常有价值的工具，可以用于 ELISA 分析等定量和定性实验。此外，亲和色谱法和蛋白质体外结合分析（pull-down assays)再加上详细表征的抗体，可以增进对代谢产物-蛋白质互作和植物硫代葡萄糖苷蛋白互作的理解。

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1楼2016-03-12 23:19:26

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引用回帖:

3楼: Originally posted by lilizhen0204 at 2016-03-29 16:07:04
还有就是检测硫代葡萄糖苷的方法，谢谢哈~

Sangthong S, Weerapreeyakul N. Simultaneous quantification of sulforaphene and sulforaphane by reverse phase HPLC and their content in Raphanus sativus L. var. caudatus Alef extracts.[J]. Food chemistry, 2016, 201.

Ares A M, Nozal M J, Bernal J L, et al. Optimized extraction, separation and quantification of twelve intact glucosinolates in broccoli leaves.[J]. Food Chemistry, 2014, 152(2):66-74.