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求助，TTC法脱氢酶活性，酶标仪测定问题
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采用TTC法测脱氢酶活性，遇到一些问题，求助 本人方法如下： 2.1 标准曲线绘制 （1）分别吸取100 μg/mL TTC标准溶液0，50 μL，100 μL，0.5 mL，0.7 mL，1 mL，2 mL，2.5 mL，5 mL，8 mL，于25 mL比色管中，定容至10 mL得标准工作液，使浓度分别为0、0.5、1、5、7、10、20、25、50、80 μg/mL，然后分别取1 mL标准工作液于10 mL带塞试管中(对照管不加TTC，加1 mL蒸馏水代替)。 （2）然后，依次加入2 mL Tris-HCl缓冲液(pH 7. 4)，1 mL 10 %硫化钠新配溶液，摇匀，放置20 min；反应完全后，各管分别加入5 mL甲苯，涡旋混匀，完全提取TF，稳定数分钟，取上层有机溶液在酶标仪上483 nm处进行比色分析，绘制标准曲线。 2.2 样品测定方法步骤 （1）称量基质样品1 g于2mL塑料离心管中，依次加入 0.05 M Tris- HCl缓冲液 0.2 mL 0.1 moL/L葡萄糖液 0.2 mL 1% TTC 0.1 mL 置于(37±10)℃恒温箱中遮光培养15 h。 （2）取出样品，加1滴浓硫酸终止反应， 甲苯 准确加入 0.5 mL 涡旋提取1 min，在8000 r/m下离心1 min，取有机溶剂层比色。 问题如下：1、在采用96孔板装待测液体时，一开始加入的乙酸乙酯、丙酮，会腐蚀管壁，形成细纹，影响通透性；而采用甲苯，时间稍长（约几分钟），96孔板变软腐蚀，但还是透明的。想问有没有用酶标仪测过的，分享下提取液的选取？ 2、在做标曲时，前面4个点的值偏高，目测是无色的，吸光度有0.1多，空白也有这么高，线性非常差。。是酶标仪的问题吗？ 3、恒温箱遮光培养时间，结果跟时间是有关系的？那么如何选择培养时间？有的6h、15h、24h、？？ 有做过的分享下经验。。。十分感谢！ |
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