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芕星悦

新虫 (小有名气)


[交流] 转录组数据返回后,考虑做qPCR的引物设计,请做过的大侠帮忙解答...

转录组数据返回后,准备做qPCR,目前在引物设计上遇到了问题。查阅的资料中还是有些不同的,那么下面我把自己记录下来的设计要求列出来,请有过经验的高手指教下。

1. 引物长度:18-24bp为宜;
2. 引物退火温度(melting temperature):59℃-68℃,而以63-64℃为宜,上下游引物间退火温度不要超过2℃;
3. 扩增退火温度(annealing temperature):59℃-60℃;
4. 扩增产物长度:50-200 bp,而以80-150 bp为宜;
5. 重复序列(Repeats):最大不要超过4次(如:ATCTCTCTCG,其中TC共重复了4次);
6. 单碱基runs:最大不要超过3-4个(如:TAAAAGC,其中A重复了4次,及A的runs是4);
7. GC夹子(GC-clamps):不要超过2个;
8. 引物GC含量:30-80%,以65%为宜。
9. 引物3‘末端:最好不要形成发夹结果,亦或配对碱基不要超过2个。

有什么不对或者不全的地方,希望得到大神的指点。
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a314919473

银虫 (著名写手)



芕星悦(金币+1): 谢谢参与
LZ估计是接触这一块吧,你搜的已经很全了。
直接用引物设计软件,慢慢找吧,用两个小时,再一段序列上设计最少两对引物,然后合成(合成引物一个碱基才几毛钱)多合成引物比你设计一对引物反复摸索条件省时省力,相信我没错的
3楼2016-03-08 10:50:23
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