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芕星悦

新虫 (小有名气)

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虫号: 1868106

[交流] 转录组数据返回后，考虑做qPCR的引物设计，请做过的大侠帮忙解答...

转录组数据返回后，准备做qPCR，目前在引物设计上遇到了问题。查阅的资料中还是有些不同的，那么下面我把自己记录下来的设计要求列出来，请有过经验的高手指教下。

1. 引物长度：18-24bp为宜；
2. 引物退火温度（melting temperature）：59℃-68℃，而以63-64℃为宜，上下游引物间退火温度不要超过2℃；
3. 扩增退火温度（annealing temperature）：59℃-60℃；
4. 扩增产物长度：50-200 bp，而以80-150 bp为宜；
5. 重复序列（Repeats）：最大不要超过4次（如：ATCTCTCTCG，其中TC共重复了4次）；
6. 单碱基runs：最大不要超过3-4个（如：TAAAAGC，其中A重复了4次，及A的runs是4）；
7. GC夹子（GC-clamps）：不要超过2个；
8. 引物GC含量：30-80%，以65%为宜。
9. 引物3‘末端：最好不要形成发夹结果，亦或配对碱基不要超过2个。

有什么不对或者不全的地方，希望得到大神的指点。

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