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kevin_pretty

银虫 (小有名气)

[求助] pCAMBIA1304载体链接不上,所用酶切位点为,nco1... 已有1人参与

pCAMBIA1304载体链接不上,所用酶切位点为,nco1和spe1?Thermo 公司酶,请问酶切链接过程中注意事项及可能存在的原因? @gyesang

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gyesang

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【答案】应助回帖

你的片段是PCR完后直接回收酶切的吗?酶切位点有没有加保护碱基
你可以将你基因片段连接T载体后,再酶切连pCAMBIA1304试试
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2016-03-16 12:02:38
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普通回帖

宇文数学

新虫 (正式写手)

2楼说得对,先连T载,再酶切成功率高,你用的快切酶还是普通酶,注意buffer的选择

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3楼2016-03-16 12:07:14
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kevin_pretty

银虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2016-03-16 12:02:38
你的片段是PCR完后直接回收酶切的吗?酶切位点有没有加保护碱基
你可以将你基因片段连接T载体后,再酶切连pCAMBIA1304试试

您好,我的片段已连接到T载体,并且测序正确。现在加酶切位点后,有加保护碱基,双酶切连接,菌液pcr有条带,但是测序为空载体!试过好几次了,还是不行。用的是thermo的酶,之前做成功一次,但是这次一直没连上?

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4楼2016-03-17 14:29:08
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learner_zyj

新虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by kevin_pretty at 2016-03-17 14:29:08
您好,我的片段已连接到T载体,并且测序正确。现在加酶切位点后,有加保护碱基,双酶切连接,菌液pcr有条带,但是测序为空载体!试过好几次了,还是不行。用的是thermo的酶,之前做成功一次,但是这次一直没连上?
...

请问楼主后来解决了吗?菌P的时候有用空载体做对照吗?

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5楼2017-04-12 10:27:55
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王方平

金虫 (小有名气)

6楼2017-04-12 12:47:36
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傻子的烦恼

新虫 (初入文坛)

你好,你现在连上了吗?可以分享一下经验吗?

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7楼2020-09-02 19:21:47
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