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hc2015

新虫 (小有名气)

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[交流] 蛋白的纯化之离子交换层的选择

蛋白质表面在溶液中一般都带电荷，带电荷的类型取决于蛋白质 pI 和溶液的 pH 。 pH 小于 pI 时蛋白质带正电， pH 大于 pI 时蛋白质带负电。不同的等电点的蛋白质在同一个溶液中，表面带电情况不同。离子交换色谱法就是利用不同的蛋白质有不同的等电点在同一个溶液中表面带电情况不同实现分离。
近似处理中，将蛋白质分子和交换基团看作点电荷，它们之间的作用力 F 为：
F=q 1 • q 2/εr 2 q 1 ， q 2 分别为蛋白质分子和交换基团两个点电荷的电量；ε为介质介电常数； r 为两点电荷间的距离。
在离子交换色谱中交换基团的电荷和大小是不变的，而样品的电荷（表面带电情况）和大小是不同的，受到交换基团的作用力也不同，从而实现分离。
与凝胶色谱基质一样，离子交换介质的基质也有 3 类：交联多糖如交联琼脂糖、交联葡聚糖，大孔硅胶和多孔玻璃，大孔有机聚合物（聚苯乙烯等）。在蛋白质的离子交换分离中主要使用交联多糖，特别是交联琼脂糖基质介质，有强阴、弱阴、强阳、弱阳 4 种，下面为国内外离子交换色谱介质的名称、基质、交换基团等性质的表格。
名称
交换基团
基质
应用
强阴（ Q ）
CH 2N +(CH 3) 3
交联琼脂糖 CL6B/6FF
蛋白质分离，除内毒素
弱阴 (DEAE)
CH 2CH 2N(C 2H 5) 2
交联琼脂糖 CL6B/6FF
蛋白质分离，
强阳 (SP)
(CH 2) 3SO 4 -
交联琼脂糖 CL6B/6FF
蛋白质分离
弱阳 (CM)
CH 2COOH
交联琼脂糖 CL6B/6FF
蛋白质分离

离子交换填料吸附量大（见下表），分辨率好，可用在工艺的任何一步。但是上样时样品溶液中盐浓度（即离子强度）不能太大，否则会不保留或分辨率差。现在有一些新的介质产品，可以允许样品溶液有较大的盐浓度。

名称
交换基团
最大吸附量（ mg/ml ）
pH 工作范围
强阴（ Q ）
CH 2N +(CH 3) 3
120HSA
2~12
弱阴 (DEAE)
CH 2CH 2N(C 2H 5) 2
110HSA
2~9
强阳 (SP)
(CH 2) 3SO 4 -
70RNase
4~13
弱阳 (CM)
CH 2COOH
50RNase
5~10
离子交换填料配基只有带电荷才能对蛋白质有吸附。强阴（ Q Bio-sep FF ）和强阳 (SP Bio-sep  FF) 介质的离解度很大，所以 pH 工作范围很宽；但弱阴 (DEAE Bio-sep  FF ) 和弱阳 (CM  Bio-sep  FF) 填料在一定的 pH 范围内离解， pH 工作范围有较大的局限。（见上表）
弱阴 (DEAE Bio-sep  FF ) 在较小 pH 值时离解度较大；而弱阳 (CM  Bio-sep  FF ) 在较大 pH 值时离解度较大。强阴（ Q Bio-sep FF ）和强阳 (SP Bio-sep  FF) 在溶液中几乎完全离解，与 pH 关系不大。
蛋白质的保留与其 pI 及溶液的 pH 值有关。
从以上两点看，使用弱阴 (DEAE Bio-sep  FF ) 时较小 pH 值离解度较大，但要大于蛋白质等电点才有保留，而弱阳 (CM  Bio-sep  FF) 较大 pH 值离解度较大，但要小于蛋白质等电点才有保留。要兼顾离解度和保留值对溶液 pH 的要求。弱阳 (CM  Bio-sep  FF ) 常在酸性下如 pH5.0 使用，此时适合 pI 大于 5.0 的蛋白质样品， pI 越大保留值越大。弱阴 (DEAE  Bio-sep  FF ) 常在碱性如 pH8.0 使用，此时适合 pI 小于 8.0 的蛋白质样品， pI 越小保留值越大。

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