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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 细胞科学 » 构建好的重组质粒，转染进入细胞，可检测到蛋白的表达，但蛋白不发挥功能
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舒晋Jean

新虫 (初入文坛)

[求助] 构建好的重组质粒，转染进入细胞，可检测到蛋白的表达，但蛋白不发挥功能 已有1人参与

各位大神好，
            本人研三即将毕业，担心毕业论文，现在我的实验遇到一个完全做不下去的困难，希望各位同仁帮我看看到底是哪里有问题，我第一次发帖求助，金币只有这么多，全掏出来了，实在不好意思。
           具体是这样的，我一直在构建Bax-pcDNA3.1V5HISC载体，做完转化后，阳性菌液就送去测序，测序结果没有问题，后面提了质粒也送过，结果也没问题，之后就转到BAX-KO细胞中，可以检测到BAX融合蛋白的表达，大约是在25KD左右，然后用G418筛选，筛了很长一段时间，还是能检测到蛋白的表达，但是问题就来，稳转的细胞系加了药之后不会发生死亡，而按道理，这类药在这类细胞中HCT116细胞中通过线粒体途径凋亡（也就是依赖于BAX）,阳性对照即HCT116WT细胞死了很多，这就是说明，我构建的BAX不发挥作用，后面我查了写资料，资料上说BAX发挥作用要多聚化，让线粒体膜通透性加大，我猜想是否是我构建的蛋白由于不多聚化所以加药之后不会凋亡，但bax的多聚化，老师说不好做，所以没有去做。所以我就换了载体pcNDA3.1+,把标签FLAG放在N端，但是结果还是不如人意，急晕了，但又无从下手。
    有没有同学和我一样的，构建好载体，蛋白表达却不发挥作用的，请问你们是如何解决的，跪求帮助！
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1楼 2016-03-04 11:54:38
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youwid

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
为什么一定要带标签？方便检测吗？还有你检测表达有，用的是抗标签的抗体，而不是抗Bax的抗体？构建一个不带标签的质粒好了，反正筛选有抗性标记。检测用直接抗Bax标记。让这个蛋白在细胞内自己多聚化。希望对你有用。
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2楼2016-03-04 13:55:25
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舒晋Jean

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by youwid at 2016-03-04 13:55:25
为什么一定要带标签？方便检测吗？还有你检测表达有，用的是抗标签的抗体，而不是抗Bax的抗体？构建一个不带标签的质粒好了，反正筛选有抗性标记。检测用直接抗Bax标记。让这个蛋白在细胞内自己多聚化。希望对你有用 ...

谢谢哇

发自小木虫IOS客户端
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3楼2016-03-08 15:32:36
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