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限制性内切酶的一般原则和建议!
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1． 如何做酶切反应？ 该问题看似什么简单： DNA中加上酶，然后保温一段时间就可以了。但是在实际操作过程中，我们不断听到：切不动，装不上。问题在什么地方？能系列生产限制性内切酶的公司国际上，就那么几个，位列前3 的是NEB, Fermentas, SibEnzyme。这些公司提供酶的品质一般都能得到保证。您可以怀疑酶的质量问题，但是更多的问题来源于模板是否合适酶切要求。下面几点对你的酶切是有帮助的。 1) 成功酶切的关键是准备好模板DNA。DNA样品中不能含有有机溶剂（会使酶变性或产生星号货性），不能含有干扰酶活性的污染物质，不能含有高浓度的EDTA (TE中的EDTA浓度较低，对Mg的浓度影响较小)；同时要对DNA甲基化程度及其对酶切效率的影响要做到心中有数。 2) 选用合适的酶。根据酶切序列选用，特别注意选用甲基化对酶活性的干扰。 3) 正确使用和保存酶。酶需要保存在-20度的低温环境中，只是在需要用酶才从冰箱中取出来。运输和临时存放时需要将酶至于冰上。手拿酶管时不要接触酶管下步含酶的部分，移酶时尽可能用长TIP, 避免污染。用完后需要及时送回原处。注意：酶通常是最后加。所有 4) 反应体积需要根据实验目的定，常规的酶切一般要维持在10-50ul，酶切鉴定10-20ul就可以了。 5) 模板浓度问题：浓度过高，溶液黏度过大，酶不能有效扩散，酶切效果不会好。浓度过低，也会影响酶活性。 6) 注意模板用量和反应体积的关系。对酶用量，模板用量，反应体积等要素的确定需要的是时间和经验的积累。 7) 酶切反应的各个组分加完后，需要用TIP小心混匀几次，short spin 一下就可以保温了。一般不能使用振荡器混匀。 8) 反应温度的选择。一般反应都用37度，但是 Sma I 的最适合温度是25度，37度时酶仍表现出活性，但是效率下降50%。部分从耐热菌制备的酶需要在37度以上的温度反应，如Taq I的最适温度为65度，37度保温，效率仅为前者的1/10。 9) 反应时间的选择。一般酶切鉴定30分钟就可以了。要完全酶切可以采用少量的酶长时间反应，或较高的酶量短时间处理都可以达到。在使用高酶量的时候需要注意甘油的最终浓度不要超过5%，也就是说10ul的体系，酶的用量不要超过1ul。 10) 是否和如何终止反应？酶切鉴定之类的实验不需要特殊处理。灭活的手段：加入高浓度的EDTA；65度或80度热处理20-30分钟；部分从高温菌纯化出来的内切酶由于最适的反应温度比较高，热处理灭活不一定完全，需要用苯酚/氯仿/乙醇方法纯化；电泳回收也是实验室常用除酶的手段。 2．如果遇到酶切不动或切不完全，该怎么办？ 要回答这么问题常常需要了解酶活性单位是如何确定，我们多次接到这样的问题：1个单位的酶能在60分钟内切1ug的DNA,为什么我们的DNA那么少切那么长时间也不能切开或切完全？ 从下面几个因素去考虑： 1) 酶是否有活性：酶的活性单位通常是在60分钟酶切1ug lambda DNA或特定线状DNA所需要的酶量。鉴定酶的活性高低不是用您待切的DNA模板，也不是别的公司的酶来判定。因为不同公司酶可能是从不同系统中纯化的，虽然识别位点相同，但是酶的特性可能是有差异的。鉴定酶必须使用使用说明书上认定的酶活确定的方式，通常需要用lambda DAN做模板来判定。同时如果酶对甲基化敏感，还需要用Dcm-, Dam-的DNA.不排除由于运输或分装不当导致酶活性下降，这种情况是很少发生。我们公司销售的SibEnzyme公司的酶，在分装前严格检验过，不合格的东西（很少）都退回原厂，所以不合格的产品是不会送到用户手头的。 2) 模板性质是否清楚：如果 DNA的类型变了所需要的酶量也不同。酶切效果与DNA的性质（线状，超螺旋状）、位点数目、位点左右的序列、甲基化程度、纯度等有很大的关系。对超螺旋状DNA完全酶切所需要的酶量要比线状的高好几倍(在我们的目录上有部分酶是有标注的)，同时需要提高酶的用量（10U/ug）和延长反应时间等措施。 还有一个问题是有些时候DNA是从别人那里得到的，背景不清楚也造成困惑。 3) 模板纯度是否够：模板制备方式影响DNA的质量，制备过程中使用到乙醇，氯仿，苯酚，SDS, EDTA等如果残留在最终的DNA模板中，都会不同程度影响酶的活性。Miniprep时如果用试剂盒抽提，需要的问题污染是变性剂和乙醇；如果是手工制备的，氯仿，乙醇，苯酚及细胞内其他杂质都会不同程度的干扰酶活性。 4) 甲基化程度对酶的活性是否有影响：细菌中主要有Dcm和Dam两种甲基化方式，在植物和动物细胞中主要是CG位被甲基化。仔细看看使用的酶对甲基化的敏感情况，或许能找到酶切效率低或根本不能酶切的根源。 5) 反应条件是否合适：对照说明书，检查使用的温度是否正确，是否需要添加BSA, 是否使用正确的缓冲溶液。由于缓冲液中基本都含有DTT,反复冻融会使模板使DTT降解。注意有些研究人员将buffer长时间放在4度或室温，这是很不规范的行为。 6) 酶稀释和添加方式是否正确：一般要求在最后加酶，但是对同时做多个相同反应的时候，最后加酶有可能不很方便。通常是将缓冲、酶和适量的水配制成一个混合物，然后分装，最后加模板。需要提醒的是混合物（Master Mix）中由于没有底物的存在，离子强度也不对，酶可能要受到损伤。这种提前混合的做法没有问题，只是动作要快一些，没有分装前的Mix，要求放在冰里，尽快使用。 3．如何设定PCR引物的保护碱基？ 如果您想直接对PCR产物酶切，同时想获得理想的酶切效果，一般情况下需要在酶切位点序列5’端方向增加额外的保护碱基。保护碱基的数目随酶的种类不同而不同，根据文献资料汇总，一般保护碱基有3-4个就可以了。不提倡提供过多的保护碱基，因为太多的额外碱基会增加PCR扩增的难度，同时增加合成费用。 4．如何对PCR扩增的产物进行酶切？ Fermentas公司的研究表明，限制性内切酶在 PCR扩增体系中仍然有部分活性，可以通过稀释（3倍以上）扩增混合液，适当提高酶量和反映时间，进行酶切。我个人认为需要对PCR产物进行酶切分析通常是为了或基因表型分析，由于Taq，Pfu等高温聚合酶在酶切温度（37度或更高）下，仍然保持一定的活性，高温聚合酶所具有的聚合或无模板添A或外切修正的功能仍在一定的程度上表现出来，可能会影响到酶切产物末端的正确性。结果是要么装不上去，要么装上去切不下来，测序发现末端引物碱基少了。正确安全的做法是先通过琼脂糖电泳回收产物，然后酶切，酶切可以适当提高酶的用量。一般的做法是从50ulPCR反应中回收的产物，溶解于45ul水中，加入酶，酶切后的产物通过从溶液中回收DNA的方式直接回收，不需要跑琼脂糖电泳。 |
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