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新人求助高手指点RACE!急急急……
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最近在做RACE，是很简单的3'RACE,但是做了半个月了，都没有P出条带来。 很着急！ 我是用自己设计的5'-GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'做反转录，然后用5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3' 与自己的特异性上游引物（1）做PCR，没有条带出现。但是我还是用这个 5'-GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'引物反转录的第一链做模板，用特异性上游引物（1）与一个特异性的下游引物（2）做中间一个片段的PCR时，却是可以P出目的条带的，不知道问题出在哪里。延伸时间已经很长了，退火温度也调到最低。两个相同的反应体系，只是下游的引物不一样而已，为什么RACE就做不出呢？求达人指点一下！ 而且我用自己设计的接头接头引物反转录出来的模板，P一些特定的片段时经常是没有结果的，而用试剂盒自带的oligDT引物反转录之后，就可以P出这些特定的条带，这是不是说明我的Race引物有问题呢？应该怎么改？或者注意什么? 还有，大家在做完反转录后PCR时，是用反转录的原液来做模板，还是稀释了多少倍后再用来做模板啊？ 好像还看到有的说明书上说要将一次反转录的原液（20ul）一次性的做某一片段的PCR，而且还不用再加DNTP（因为反转录时已经加了），有人这样做过吗？ |
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