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第二部分 p-IRAK1水平对肝癌细胞增殖、迁移、细胞凋亡及细胞周期等细胞生物学功能的影响及作用机制研究 中文摘要 目的：基于前期研究发现IRAK1在肝癌及肝癌细胞系中明显升高及在不同位点磷酸化状态及水平的差异，预示IRAK1在肝癌发生发展中发挥了重要作用。本研究目标为阐明IRAK1及p-IRAK1水平及状态在肝癌细胞迁移、增殖、凋亡、细胞周期等生物学功能中的重要作用，以及P-IRAK1水平对裸鼠肝癌皮下荷瘤增殖及促肿瘤生长的影响，揭示IRAK1在肝癌发生发展中的分子机制。验证IRAK1/4小分子抑制剂或者干扰细胞系下调p-IRAK1磷酸化的表达水平在肝癌治疗中的重要协同作用。 方法：釆用Western Blotting技术检测IRAK1、p-IRAK1(T209)的磷酸化水平在IRAK1/4化学试剂或者肝癌干扰细胞系在肝癌中的表达情况；运用IHC法检测IRAK1/4化学试剂或者干扰细胞系对皮下肝癌荷瘤增殖因子的影响作用；运用不同剂量IRAK1/4小分子抑制剂抑制肝癌细胞中p-IRAK1(T209)的磷酸化水平。采用Cell Counting Kit-8（CCK-8）增殖实验、细胞克隆实验研究p-IRAK1(T209)的磷酸化水平对肝癌细胞增殖能力的影响；运用AnnexinV和PI染色联合流式细胞术研究p-IRAK1(T209)的磷酸化水平对肝癌细胞凋亡和细胞周期的作用；运用Transwell迁移实验、划痕实验研究p-IRAK1水平肝癌细胞的粘附、迁移能力的影响。采用SiRNA介导的RNA干扰技术干扰肝癌细胞IRAK1及磷酸化表达，运用Cell Counting Kit-8（CCK-8）研究IRAK1/4化学试剂或者小分子干扰下调IRAK-1及磷酸化水平对细胞增殖能力及皮下肝癌荷瘤生长的影响。 结果：Western Blotting检测结果显示，IRAK1/4抑制剂能明显下调多种肝癌细胞系中P-IRAK1(T209)水平，20um的抑制效果明显强于10um，20um是较理想抑制量，而p-IRAK1 (S376)、IRAK1总体水平变化不明显；应用SiRNA干扰IRAK1的表达水平，肝癌细胞系中IRAK1表达明显下调，P-IRAK1（T209）磷酸化水平不同程度的降低，SiRNA干扰IRAK1、P-IRAK1（T209）磷酸化水平效果显著。IRAK1/4抑制剂可通过抑制肝癌细胞P-IRAK1(T209)水平，进一步诱导肝癌细胞凋亡，引起肝癌细胞周期阻滞；IRAK1/4抑制剂可通过下调P-IRAK1(T209)，有效抑制肝癌细胞增殖、迁移能力，降低肝癌细胞的克隆水平；SiRNA转染肝癌细胞系，通过下调IRAK1、P-IRAK1（T209）磷酸化水平，抑制肝癌细胞增殖率，与NC组比较具有显著性差异（P<0.05）；降低P-IRAK1（T209）磷酸化水平可减少增殖相关因子Ki67的表达水平。IRAK1/4抑制剂或者干扰细胞系能明显抑制肝癌皮下荷瘤的生长，与NC组比较具有显著性差异（P<0.05）；IRAK1/4抑制剂或者干扰细胞系肿瘤组织异常度低，仅出现少量坏死组织，细胞核固缩、碎裂及溶解较少，NC组织异常明显，出现大量坏死组织，细胞固缩、碎裂及溶解明显。 结论：验证了肝癌细胞中IRAK1、p-IRAK1(T209)的水平及状态与肝癌细胞迁移、增殖、凋亡、细胞周期等生物学功能密切相关，具有重要的调控作用；进一步证实了IRAK1/4抑制剂或者RNA干扰细胞系通过抑制P-IRAK1（T209）磷酸化水平并抑制肝癌细胞增殖及肿瘤生长的重要作用；揭示了IRAK1在肝癌发生发展过程中的作用与IRAK1磷酸化水平密切相关，IRAK1/4抑制剂或者RNA干扰技术在肝癌治疗中具有重要协同作用，为肝癌治疗提供了新的治疗理论基础和实践证明。 |
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