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LAILIHONG25新虫 (初入文坛)
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[求助]
代谢分析，紧急求助指点！！！
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本人最近在鉴定一个新化合物在大鼠体内形成的可能代谢物。化合物结构如A图，化合物分子式C35H44N2O7S2，分子量668. Q-TOF负离子模式下化合物的二级质谱图如B图，之前有请教过别人对二级质谱进行解析，解析结果如C图。我在对肝脏结果进行分析时，对比空白样品，发现肝脏中存在715这样的一种代谢物。但是在提取715的EIC图时，发现提取出来的EIC图有很多峰，且有些分离的不好。715的EIC图为图D。现在就有以下几个问题，紧急求助大神指导！！！ 1、因为我之前看到一些代谢相关文献里存在同分异构体代谢物的情况。参考了D图中各个色谱峰对应的质谱图，我认为D图中那些不同保留时间的色谱峰是715这个代谢物的不同同分异构体。但是按照这样分析，发现715的同分异构体很多有10个，我不知道我对D图的分析对不对？！还有这样的色谱图能用吗？！因为分离的不是很好，我很担心不能用，但是之前调节流动相比例后发现也没有多大的改善，这个该如何解决？！求大神指导！！ 2、在对母药二级碎片离子进行分析时，发现碎片离子都是侧链部分形成的，母环这部分没有相关的特征离子，可能的原因是碰撞能量太大。不过这个碰撞能是仪器自行优化的。因为化合物的特征碎片离子与之后的代谢物鉴定息息相关，在这种情况下，确定母药化合物的特征碎片离子，行吗？！！ 3、在默认2中可行的情况下，我对715的EIC图中的各个色谱峰的二级质谱进行分析时，发现M1-M5的二级质谱碎片离子一样，为图E（图为代表图）；M6-M9的二级质谱图为图F（图为代表图）；M10的二级质谱图为图G。根据它们的质谱结果推测M1-M5可能是化合物侧链硫醚键氧化+母环二羟基化的同分异构体；M6-M9可能是化合物母环三羟基化的同分异构体；M10可能是化合物硫醚键双氧化+母环一羟基化的同分异构体。在推断可能的结构时，参考了母药二级质谱的解析以及类似结构化合物的代谢分析，但是因为上述代谢物的二级碎片很少，且都是侧链部分形成的，我只能做到上述的推断，而不能再做进一步的分析了。这样对可能的代谢物进行鉴定，行吗？还有我对上述代谢物的形成方式的推断正确吗？ 本人是第一次接触代谢分析，有很多不懂的地方，向周围他人又没法寻求帮助，只有在这请教各位大神了，问题有点多，老板催的紧，挺着急的，衷心希望各位大神能够不吝指导，谢谢！！！ ps:上述图片见附件 |
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2016-02-25 17:03:05, 94.5 K
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old_yang
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LAILIHONG25: 金币+10, ★★★很有帮助 2016-02-26 11:43:15
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如果药物原型为668， 那么你通过大鼠的代谢，得到715，增加了47， 你既然有高分辨，你可以得到：715的元素构成，通过减去668的元素构成，发现多了什么元素？以验证你推测的氧化和羟基化产物，但是上一个羟基，分子就增加16，两个就多32，三个羟基是48。有可能上三个羟基。 你的668解释的比较清楚，应该没有太大问题。但715的解释没有看到。 M1至M10的分子量分别列出来，如果只有很小的差别，说明它们是一组同分异构体，如果你仔细比较了M1和M10的碎片，结合668比较，有可能发现715的羟基的位置。 以上是质谱的工作。 我觉得你可能漏掉了一些代谢物，例如结合型的代谢物，你查过这个药物的或者类似药物的代谢规律吗？例如有没有葡萄糖醛酸结合型的？有没有硫酸酯型的结合物？有没有其他氨基酸结合型的？ 仅仅和空白比较还不够。你的提取方法是什么？直接进样还是采用其他处理？你是否做过GC--MS? 液质的结果只比较TIC的差异还是不够的，因为TIC的明显的你能看到，还有很多峰是要靠提取离子才能看到。如果你不知道的话，就会漏掉很多信息。你不是有代谢软件吗？先把这个药物可能有的代谢途径搞清楚，然后列一个表，把分子式，负模式的精确质量算一下，然后去TIC上提取代谢后的和阴性对照的图。 对于新发现的代谢物，结构鉴定还要考虑液相分离，然后收集，然后通过核磁确定结构。（当然是有条件才行） |
2楼2016-02-25 20:03:55
old_yang
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【答案】应助回帖
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不知道你的药物叫什么名字，看到结构中有磺胺基团，应该有羟基的代谢物，给你一篇文献参考参考吧。 你可以试试找一下上一个羟基的，两个羟基的，三个甚至5个羟基的，还有其他的代谢途径。多查类似文献。 |
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2016-02-25 21:13:30, 312 K
3楼2016-02-25 21:13:32
LAILIHONG25
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首先非常感谢您的解答，我从中受益匪浅。 在对这个化合物进行代谢物鉴定时，我是在参考沃尼妙林和磺胺类药物代谢方式的基础上进行的，同时也结合了代谢物预测软件的预测结果进行分析，不过目前并没有发现II相结合型代谢物，但是发现此化合物的代谢方式与上述沃尼妙林相似。即主要是化合物发生氧化。因为除了上述的715，我还发现有683、699、731这些代谢物，而且每个代谢物仍像715那样存在不同的同分异构体。 但是在对它们的结构进行推断时，由于二级质谱碎片离子都是侧链上形成的，只能对侧链上的基团变化情况进行推测，而母环那部分如何变化则因为没有相关的质谱数据，我只能通过参考与它有相似母环结构的沃尼妙林的代谢方式进行猜测（如当715某个代谢物二级碎片离子跟母药化合物668是一样时，即碎片离子都是侧链形成的且和母药相比没有发生变化，在参考沃尼妙林母环代谢方式的基础上，我认为此时化合物母环是发生了三羟基化，侧链则没有发生变化）。但是像这样因代谢物中母环部分没有相关的质谱数据，而仅仅是参考了其它相似药物的代谢方式对这个化合物的代谢方式进行猜测，这样鉴定的代谢物有说服力吗？！能行吗？！我现在很担心这一点。衷心希望能再次得到您的帮助，谢谢!!! PS:附件是上述所说的沃尼妙林代谢的一篇文献 |
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2016-02-26 11:41:23, 3.02 M
4楼2016-02-26 11:41:40
old_yang
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LAILIHONG25: 金币+10, ★★★很有帮助 2016-02-27 10:27:08
LAILIHONG25: 金币+10, ★★★很有帮助 2016-02-27 10:27:08
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因为除了上述的715，我还发现有683、699、731这些代谢物，而且每个代谢物仍像715那样存在不同的同分异构体。 （1）这些都是代谢物，把测到的精确质量，与原型药物相减，比较出元素的异同，然后分析可能的代谢途径； （2）你查的Valnemulin的文献很有用，母环带1-, 2, 3-OH的化合物都有，只要跟你的图能对应上就能应该能解释； （3）质谱裂解规律多数是基于实验结果的，所以，你可以选择不同的碰撞电压再做做，虽然你说电压是优化的，但对于数据的全面掌握不能只采用优化的一种参数，应该所有允许的范围内都看看，你会有新发现。 （4）如果这个类似的药物同时含有磺胺和母核的两种基团，它的代谢途径很可能两种都有，这要仔细根据实验结果去分析了，不能认定一定是母核发生了改变，否则很可能漏掉一些信息。 （5）你做的药物，虽然不是文献中的那个，但文献里提到药物你有吗？或者有类似结构的药物吗？如果有结构很接近的，你可以做几个，作为对照品，一样可以提供有用信息来解谱。 如果有可能，还需广泛、深入、详细查文献，只要能支持解谱的文献都是有用的，都可以做为依据来支持你的实验发现。 |
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5楼2016-02-26 13:24:30
old_yang
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多查类似文献， 你的数据都是负模式的，正模式是否做过？ 有时候正模式的裂解和负模式是不同的，有些基团在正模式下有很好的响应，你应该都做一下。 |
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LAILIHONG25
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LAILIHONG25: 金币+10, ★★★很有帮助 2016-02-28 15:54:40
LAILIHONG25: 金币+10, ★★★很有帮助 2016-02-28 15:54:40
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药物代谢方面的书中，药物的一相代谢物是指羟化，还原，氧化，甲基化，去甲基化，等等都归为一相代谢，phase I; 而把药物原型或者一相代谢物与其他分子结合的复合物称为二相代谢， Phase II, 例如药物和硫酸酯、葡萄糖醛酸、氨基酸、等等其他大一点的基团结合的称为二相代谢物； 有的药物既这两种代谢物都有，而有的药物则只有某一相代谢物，这要看分子的理化性质而定。一般，水溶性强的，极性强的分子，进入生物体内，很容易排出，因为水溶性好，或者发生了羟化后，水溶性更好，很快排出，而没有时间和其他分子结合，所测到的都是一相代谢物；如果是极性弱的分子，就很难排出，因为亲脂性，所以排出很慢，只有结合了某些基团后，例如葡萄糖醛酸、硫酸根等才增大水溶性被排出体外。所形成的就是二相代谢物为主。 形成这些代谢物的种类不是以时间为依据划分的，一小时也算很长了，生物体内发生的催化反应往往很快就发生了，很可能两种都有。 你读些药代方面的书会好理解一些。 从实验角度看你的问题的话，应该是对药物不知道它如何代谢的，就先假设它会发生很多种代谢，因为动物体内各种酶都有，一个药物来了， 肯定是和这些酶都接触一下， 然后哪种酶能影响这个药物，就发生什么结果。这种结果产生以后，例如，血被你采集了，或者肝细胞被你匀浆了，等等 你去检测，看看能测到什么，与预先设想的一样，那么就有某种代谢途径（羟化），如果没有发生变化，就是原型排出体外，这样的药物也有很多种。 |
8楼2016-02-27 14:32:15
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我可以直接认为它们都是由母药化合物羟基化形成吗？ 可以直接认为它们都是由母药化合物羟基化形成 还有因为它们在1小时都出现，那该如何判断它们之间有没有转换关系呢？ 目前，你的数据很难证明，它们之间有转换关系。可能同时形成的，也可能是，逐渐形成的（1-OH, 2-OH, 3-OH） 不要局限在715只中， 还有大量的其他工作等你分析，715的10个异构体只是一个实验结果，重点是其他的发现。还原、乙酰化、甲基化、等等。 |
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9楼2016-02-27 14:39:18
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非常谢谢您仔细的解答。不过我还有些问题想再请教您。 1、最近我在分析时发现有母环脱氢且羟基化的氧化代谢物，分子量为681、697、713、729，与上面的683、699、715、731相比少2，在用代谢软件对母药化合物进行代谢预测时也发现有这种代谢方式且根据预测软件提示，脱氢部位是在母环游离的羟基处。但是之前分析的母环羟基化代谢物也有游离羟基也能发生脱氢氧化反应，那我该如何去判断上述脱氢且羟基化的代谢物它们是化合物先脱氢后羟基化还是先羟基化后脱氢形成？或者是不是也有可能是由母药化合物直接同时脱氢、羟基化形成？这种情况下可以根据哪些信息去判断它们形成的先后顺序？或者说关于脱氢、羟基化这2个代谢方式从常见的代谢原理的角度看有没有先后顺序之分，比如一定是先脱氢后羟基化或者相反，我在这方面没有找到相关的资料，不知您是否有相关的经验? 2、如果上面关于先羟基化还是先脱氢氧化无法确定，在这种情况下推测代谢途径时，我能否把上述的可能性都考虑在内来绘制可能的代谢途径呢？个人理解是可以的，因为我觉得根据代谢物来推测的代谢途径本身就是一种可能性而已，并不能完全确定？不知我的理解有没有错？ 3、从常见的代谢原理看，化合物侧链部分硫醚键处可能发生双氧化吗？文献中报道的有相似结构的沃尼妙林代谢物中只有侧链硫醚键发生单氧化的，但是我在分析过程中有发现侧链双氧化的，目前推测双氧化是发生在硫醚键处，不过我不确定这种双氧化合不合理，可能存在吗？ 问题有点多，再次谢谢您之前对上述问题不厌其烦的解答，也衷心希望能再次得到您的指导。 祝愿您心想事成，万事如意。 |
10楼2016-02-28 15:50:07