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Trizol法提取的RNAA260/280比值低于1.8，怎么回事？？或是怎么可以进一步纯化 已有1人参与
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Trizol法提取的象甲触角RNA，A260/280比值一直低于1.8，不懂是哪一步有问题。我严格按照上面的步奏进行，每次提取的上清液有体积要求吗？或是怎么可以进一步纯化？ 发自小木虫Android客户端 |
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励热心回帖交流 2017-06-21 22:52:48
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西门吹雪170: 金币+3, 鼓励热心回帖交流 2017-06-21 22:52:48
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280、320、230、260nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白等有机物的值。 A230 测定其它碳源物质，如酚，糖类等； A260 是核酸的吸收峰测 RNA 和 DNA，引物等的浓度用的； A280 是蛋白质的吸收峰。 一般的，我们只看 OD260/OD280（Ratio，R）——1.8~2.0时，我们认为 RNA中蛋白或者时其他有机物的污染是可以容忍的，不过要注意，当用 Tris 作为缓冲液检测吸光度时，R 值可能会大于 2（一般应该是<2.2的）。当 R<1.8时，溶液中蛋白或者其他有机物的污染比较明显，你可以根据自己的需要决定这份RNA 的命运。当 R>2.2时，说明 RNA 已经水解成单核酸了。 纯RNA 的A260/A280的比值为 2.0。 OD260/OD230的比值还表明 RNA 的纯度——其值 <2.0 表明裂解液中有亚硫氰胍和β-巰基乙醇残留，其值 >2.4，需用乙酸盐，乙醇沉淀 RNA。 |
2楼2017-06-12 15:57:45
【答案】应助回帖
★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励热心回帖交流 2017-06-21 22:52:30
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励热心回帖交流 2017-06-21 22:52:30
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附： 260/230的值，一般不要小于2.0，小的话表明有异硫氰酸胍，β-巯基乙醇或乙醇的残留。补救的方法是再沉淀一次，然后重复乙醇洗涤的过程。但从我的经验看，后面RNA丢得很多……因此提RNA时就注意了 个人经验，260/230偏小的话，提取时可以改进以下几点： 1.加氯仿抽提后取少一点上清，不要贪多。 2.加乙醇洗的时候，多晃几次，尽量让RNA沉淀整片悬浮起来（有时候确实浮不起来也没办法。） 3.弃乙醇的时候，用枪吸而不是倾倒，倒的话经常有液滴留在管壁上，倒不干净。第一次用蓝枪头吸，可以不完全吸干，免得吸到沉淀；然后短暂离心把残余酒精甩到管底，看准了用白枪头尽量吸干净。RNA量大，被白枪头弄掉一点也没关系。 4.溶解前晾干的时间可以长一点，5分钟也没关系的。标准的做法说是不能晾太久，等沉淀开始变透明就要加水溶解，但是我晾过10分钟的，后面RNA量也很大。可能量大，虽然有些溶解不了，最后浓度还是高。 可能不完全正确，但是以前我出现过260/230偏小的问题，按上面方法改进了操作，后面就好了。 还有一种原因可能是多糖类杂质残留，可试试用LiCl沉淀。 RNA溶液的OD260/230的比值在0.2左右，参考资料显示这个比值应该在2.0附近。我觉得你可能根本没有提出rna，按理说有蛋白污染之类的话也不会如此之低。 |
3楼2017-06-12 15:59:26
4楼2017-06-13 09:26:59
阳yang洒洒5楼2017-06-14 09:46:50
6楼2017-06-21 21:51:56