| 查看: 86 | 回复: 7 | |||
| 【有奖交流】积极回复本帖子，参与交流，就有机会分得作者 科研虫子小助手 的 1 个金币 ，回帖就立即获得 1 个金币，每人有 1 次机会 | |||
[交流]
蛋白实验 | 免疫共沉淀
|
|||
|
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）是一种利用抗原与抗体之间的专一性为基础，广泛应用于研究蛋白质与蛋白质相互作用的经典研究方法。 原理 如果细胞内两蛋白（A、B）有直接或间接的相互作用时，那么在温和的裂解条件下获得的蛋白样品中加入 A 蛋白的抗体将A蛋白沉淀下来，在细胞内与A蛋白直接相互作用的B蛋白或与其间接相互作用的C蛋白能一起被沉淀下来。使用western blot检测沉淀中是否存在B或C蛋白来确定B或C蛋白与A蛋白的相互作用。 用途 1、检测A、B蛋白在体内是否相互结合 2、分离与A蛋白相互作用的蛋白复合物 优缺点 优点： （1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态； （2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响； （3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。 缺点： （1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用； （2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用； （3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。 步骤 一 细胞的铺板与转染 1、提前一晚将293T细胞铺板至6 cm皿中，铺板量以达到相应的转染试剂要求为准； 2、用各实验室相应的转染试剂将以下质粒组合转染两皿细胞：flag 空载+HA-B；flag-A+HA-B；每质粒2微克。 二 免疫沉淀 1、转染24小时后，收获细胞，每皿加入500 μL裂解液，收集细胞至1.5 mL EP 管中，在冰上超声破碎细胞； 2、超声好后，4℃，12,000 g，离心30分钟，取400 μL上清液用于免疫沉淀，80 μL上清用作总蛋白并加入等体积的2Ⅹ loading buffer； 3、将400 μL上清加入用裂解液清洗了3遍的beads中，加入0.3-0.5 μg flag抗体，4℃孵育 3-4 小时； 4、4℃，2,000 rpm，离心3分钟，去除未结合的液体，留下beads沉淀，用预冷的蛋白裂解液清洗沉淀3次，每次5分钟； 4、最后一次去除清洗液，往沉淀中加入60 μL 2Ⅹ loading buffer，和总蛋白一起在沸水中煮沸 15 分钟。 三 Western Blot 检测 通过 SDS-PAGE 分离样品，利用全蛋白样品作为对照，检测flag-A和HA-B蛋白是否发生结合。 注意事项 1、对于内源的Co-IP检测应该用10cm皿来培养目的细胞，并维持较好的生长状态； 2、如果该实验用于新蛋白的鉴定，应注意抗体重链和轻链的影响； 3、该实验不能确定蛋白之间的相互作用是直接还是间接的。 |
回复此楼» 猜你喜欢
早点放榜吧
已经有4人回复
-
美国圣路易斯华盛顿大学李晓卫实验室诚招博士后
已经有0人回复
-
消化系统论文润色/翻译怎么收费?
已经有53人回复
-
俄亥俄大学医学院骨性关节炎实验室博士后招聘
已经有6人回复
-
俄亥俄大学医学院骨性关节炎实验室博士后-研究方向：生长激素对骨性关节炎的影响
已经有6人回复
-
Washington University in St. Louis.医学院生物工程相关博士后招聘
已经有9人回复
-
俄亥俄大学医学院生物医学系骨性关节炎实验室博士后招聘
已经有6人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 抢金币啦！回帖就可以得到:
-
替老弟发个帖--寻找有缘的她
+2/862
-
基金祈福
+1/281
-
E03青年送了么?
+1/70
-
90后男北京真诚征婚 (征到即删，长期有效)
+1/68
-
坐标郑州及附近，诚征女友
+1/67
-
90后男北京真诚征婚 (征到即删，长期有效)
+1/66
-
新能源材料-化学方向博士招收-温州大学国家级人才课题组
+1/31
-
中国科学院过程工程研究所能源与环境催化课题组招聘研究助理启事
+1/29
-
浙大博后招聘、访学招聘---课题方向不限
+1/16
-
【香港城市大学】范战西教授课题组招收博士研究生（2025秋，全奖）
+1/13
-
青岛农业大学植物医学学院蔬菜病害成灾机制与绿色防控课题组科研助理招聘启事
+2/12
-
新乡医学院招聘：科研助理，待遇优厚
+1/8
-
冶金、材料大佬们在哪里
+1/8
-
招聘 与电路设计有关博士后、研究人员、研究生，多谢帮助襄扶
+1/5
-
PMS-fenton反应交流——过一硫酸盐（征求交流合作）
+1/4
-
德国科隆大学物理系Paul van Loosdrecht教授研究组招聘超快光谱方向博士生
+1/4
-
ebsilon软件模拟、压缩二氧化碳储能技术交流
+1/4
-
清华大学深圳国际研究生院-周学拳课题组诚聘博士后/科研助理/硕博
+1/3
-
Biomaterials期刊返稿时间求助
+1/3
-
被挤兑
+1/1
+2/862
简单回复
2024-05-09 14:06
回复
2024-05-09 14:11
回复
nono20094楼
2024-05-09 16:03
回复
科研虫子小助手(金币+1): 谢谢参与
·
tzynew5楼
2024-05-09 23:47
回复
科研虫子小助手(金币+1): 谢谢参与
wwjdwwjd6楼
2024-05-10 00:13
回复
科研虫子小助手(金币+1): 谢谢参与
庚辰辛丑7楼
2024-05-11 19:45
回复
科研虫子小助手(金币+1): 谢谢参与
三千里悟道8楼
2024-05-14 10:56
回复
