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动物造模 | 黑色素瘤小鼠模型
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恶性黑色素瘤是起源于神经嵴的黑色素细胞恶性肿瘤。黑色素瘤占皮肤恶性肿瘤的第三位，由于其发病率和死亡率增加迅速，已成为全球健康负担。与其他恶性肿瘤相比，黑色素瘤治疗的总体成功率仍然是最差的之一。研究肿瘤发病机制、浸润转移及药物的治疗反应对改善肿瘤患者预后至关重要，好的动物模型能够较好地模拟疾病状态，为全方位的研究提供可能。 动物的选择 目前常用的模式生物有果蝇、酵母、小鼠、斑马鱼等。目前主要是小鼠黑色素瘤模型。 造模方法 黑色素瘤小鼠模型可分为诱发性模型、移植性模型、转基因模型。 一、诱导性模型 应用：诱导的小鼠模型模拟人类受外界因素影响获得的黑色素瘤，常用于研究预防黑色素瘤形成。 1 紫外线诱导的小鼠模型 通过紫外线照射获得的黑色素瘤模型被认为是临床上可靠的模型。 方法：有研究者将HGF /SF cDNA 表达的小鼠置于日光灯下用不同剂量( 6.24 kJ/m2UVB、3.31 kJ/m2UVA、0.03kJ/m2UVC) 进行紫外诱导15 min。 模型验证：诱导后的小鼠出现皮肤发红，偶有浅表皮脱屑，在组织病理学中观察到小鼠产生的大多数皮肤黑色素瘤中具有真皮成分，病变显示具有垂直生长期或浸润性恶性黑色素瘤以及淋巴结转移，这些病变与人类患者黑色素瘤页面状扩散的表皮内病变特征相似。 缺点：但野生型或正常型小鼠一般不易发生UV诱导的黑色素瘤，因此UV诱导的黑色素瘤小鼠模型往往需要联合免疫缺陷小鼠，其操作技术较难、成本较高。 2 化学诱导 化学致癌物诱导黑色素瘤小鼠模型大多采用DMBA和TBA诱导。DMBA是一种免疫抑制多环芳烃，其致癌机理是其活性代谢物被CYP450代谢成致癌物1，2－环氧化物-3，4-二醇 DMBA，进而损伤DNA。TPA是通过激活蛋白激酶C充当肿瘤启动子，进而使一些生长因子受体磷酸化。 方法：有研究者用100μL的0.1%、0.5%、1%的DMBA的丙酮溶液涂抹于6周龄雌性C3H /Hen小鼠已剃毛的背部皮肤。在DMBA涂抹一周后，每周两次将TPA( 40 nmol) 施用到相同部位。 模型验证：几周后，小鼠背部皮肤上出现色素沉着斑点。组织学研究表明，小鼠真皮组织中色素细胞积累，某些色素细胞表现出嵌套的形态学模式。 缺点：化学诱导黑素瘤小鼠模型缺乏与人类疾病的临床相关性。 另外，此类模型可用于研究阳光对黑色素细胞痔转化为侵袭性的黑色素瘤的过程中起的作用。由于小鼠模型的免疫系统功能全面，因此也可以用于研究免疫治疗策略。 二、移植性模型 移植模型是目前应用最多的肿瘤模型。 应用：移植接种的黑色素瘤小鼠模型概括了黑色素瘤原位发展、转移的一些特点，多用于抗肿瘤和转移药物评估。 1 同种移植模型 同种移植模型是将小鼠黑素瘤细胞接种到具有相同遗传背景的小鼠中获得小鼠黑素瘤模型。此模型包括ICR小鼠的 Harding-Passey 黑色素瘤模型、DBA小鼠的 S91黑色素瘤模型、C57BL /6 小鼠的B16黑色素瘤模型，其中C57BL /6小鼠的B16黑色素瘤是最常用模型。 优点：同种移植模型具有免疫能力，可通过黑色素细胞与免疫细胞之间固有的相互作用来研究黑色素瘤与微环境的关系。 缺点：该移植模型的原发肿瘤出现与转移发生之间时间间隔短，不利于药物药效研究; 且肿瘤细胞为鼠源，与人类肿瘤有一定的差异。 2 异种移植模型 异种移植模型是将人类的肿瘤细胞或组织移植入免疫缺陷型实验动物体内。此模型一般采用免疫缺陷型小鼠，例如无胸腺裸鼠、CB17-SCID 小鼠、NOD/SCID 小鼠、NSG小鼠。一般来说，免疫缺陷程度越高，成瘤性越好。癌症的相关研究中，人源细胞系异种移植 ( cell-line-derived xenograft，CDX) 模型和患者肿瘤组织异 种移植 ( patient-derived xenograft，PDX) 模型已得到广泛应用。 2.1 CDX 模型 方法：将 5 × 106的人 A375 黑色素瘤细胞皮下注射NOD/SCID 小鼠腹侧的双侧，成功构建黑色素瘤CDX 模型。 2.2 PDX 模型 方法：有研究者将93 个新鲜的患者肿瘤组织切成 2×2×2 mm3碎片的大小，皮下接种6周大的NOD/SCID 雌性小鼠，建立 PDX 模型。 优点：保留了病人的肿瘤组织学和遗传学特征，可模拟溃疡状态对人类黑色素瘤预后的影响。 缺点：此模型移植后的潜伏期长，连续传代后鼠基质被人类基质替代，移植率可变，免疫系统受损，有移植物抗宿主病的可能性以及某些免疫细胞功能的缺乏。 三、转基因小鼠模型 可以通过异位表达癌基因，引入特定的致癌突变或灭活肿瘤抑制基因来对小鼠进行转基因黑色素瘤模型的构建。转基因小鼠对黑色素瘤发生的分子途径的理解有重要意义。此外，转基因小鼠是可靠且可重现的模型，用来评估受损基因对黑色素瘤生物学的影响。 应用：基因工程小鼠模型可用于研究特定基因组改变在黑色素瘤的发生和发展的重要性及药物的靶向治疗。 1 Lum－/－基因敲除小鼠 Lumican是一种富含亮氨酸的小蛋白聚糖( small leucine-rich proteoglycan，SLRP) ，为胶原原纤维形成的关键调节剂。黑色素瘤中Lumican表达降低与浸润相关。 方法：有研究者利用BamHI建立的克隆衍生物导入胚胎干细胞，建立Lum－/－转基因小鼠。该模型可提供与肿瘤发生和转移相关机制及可见性肿瘤病变的进展，以及确定负责的黑色素瘤进展的基因。 2 Tyr: : N-RasQ61K转基因小鼠 方法：有研究者使用突变的人N-ＲasQ61K和SV40 剪接以及聚腺苷酸化序列生成 Tyr: : N-ＲasQ61K构建体，并注射到卵母细胞中，建立 Tyr: :N-ＲasQ61K转基因小鼠。 3 BrafV600E转基因小鼠模型 有研究者使用LoxP-stop-LoxP ( LSL) /Cre重组酶技术从内源性Braf基因中诱导 BrafV600E表达，建立BrafV600E转基因黑色素瘤小鼠模型。 总结 目前已有三种不同的黑色素瘤小鼠模型，但由于实验动物与人类基因组、基因调控、细胞类型、器官结构与组成等方面是有一定差别，这些模型预测药物治疗临床疗效的能力有限。因此，要根据各种动物模型的特点、适用范围及研究目的来考量，以选择和建立理想的动物模型。此外，在构建黑色素瘤小鼠模型研究中小鼠和人之间的差异性也应当考虑，例如小鼠的免疫系统及代谢等方面与人类有一定的差距，提示我们可以进一步研究人源化小鼠模型用于黑色素瘤模型的构建。总之，继续探究合适黑色素瘤小鼠模型，人们将逐渐发现肿瘤的发展机制、与宿主之间的关系、侵袭和转移的过程，进而找到有效的治疗方法。 |
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