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NanoFCMlxq

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外泌体相关研究文献分享,轻松读完一篇文献（十）
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今天分享一篇发表在Cells（2021年IF=6.6）上的文章，名为《Compositional Features of Distinct Microbiota Base on Serum Extracellular V esicle Metagenomics Analysis in Moderate to Severe Psoriasis Patients》[1]（ 基于血清细胞外囊泡宏基因组学分析的中重度银屑病患者不同菌群的组成特征）。

慢性斑块状银屑病或寻常型银屑病是银屑病最常见的形式，其临床特征是位于头皮、肘部、膝盖、脐和腰部的红色和鳞状皮肤斑块反复发作。银屑病患者不仅患有炎症性皮肤病，而且还经常患有并发症，如高脂血症、二型糖尿病、肥胖症、炎症性肠病(IBD)和心血管疾病。显然，银屑病是一种全身炎症性疾病，开发新的潜在治疗策略至关重要。

原核生物和真核生物分泌的细胞外囊泡(EVs)负责细胞间的通讯。EVs的不同内容物、大小和浓度反映了其来源细胞的状态，并作为各种病理状况的生物标志物。来自供体细胞的EVs的脂质双层膜携带内容物，如DNA、RNA (microRNA、mRNA、长非编码RNA)、蛋白质和脂质，它们随后聚集到受体细胞的胞质溶胶中，从而触发免疫调节。最近，来自免疫细胞的EVs被证实参与了银屑病的发病机制。许多研究表明Th17细胞和Th17途径在银屑病的发生发展中起着越来越重要的作用。白细胞介素-17A (IL-17A)作为Th17细胞的下游效应分子，可诱导成纤维细胞和上皮细胞分泌多种细胞因子，促进局部炎症反应。有研究表明银屑病皮损中肥大细胞和中性粒细胞数量的增加有助于致病性细胞因子IL-17A通过EV形成的释放。也有研究者检测到银屑病患者体内产生IL-17A的外泌体增多。靶向游离IL-17及其受体的药物是目前治疗银屑病最有效的方法。EVs的释放是银屑病炎症状态下角质形成细胞和中性粒细胞之间的双向交流。银屑病角质形成细胞通过分泌型EVs中的特异性microRNAs诱导Th1/Th17细胞极化，进一步促进银屑病发展。除了免疫细胞分泌的EVs作为银屑病的致病因素外，包封的microRNA被认为是银屑病的生物标志物。来自细菌的EVs，称为膜泡(MVs)或外膜泡(OMVs)，分别来源于革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，也含有微生物相关的分子模式(MAMPs)，如核酸、脂多糖(LPS)、肽聚糖或毒素来调节免疫。这些MAMPs被宿主中免疫和非免疫细胞表达的不同家族的模式识别受体(PRRs)识别，并进一步触发免疫调节信号。无论真核生物和原核生物分泌的肠道病毒如何，肠道病毒的特点是在循环系统中运输。皮肤或肠道微生物群的生物失调是导致先天和适应性免疫不足的危险因素。肠-皮肤轴是银屑病发病的关键因素。微生物来源的肠道病毒可在体液中检测到，并在微生物与宿主的相互作用中发挥重要作用。病原体衍生的EVs已被证明可以调节疾病的发展，如中性粒细胞性肺部炎症和特应性皮炎。已经发现有益微生物来源的肠道病毒可以改善炎症并影响远端宿主细胞。对EV宏基因组的深入分析可能是系统检测细菌-宿主关系的一种极好手段。研究表明，肠道或皮肤微生物群在银屑病中起着关键作用；然而，没有研究分析系统性微生物因素。本研究调查了银屑病患者和健康对照者血清中微生物EVs的多样性和丰度。全长16S宏基因组分析确定了生物学和统计学上有意义的细菌EV分类群作为诊断模型。

研究过程：

一、样本收集

血清标本采集自银屑病患者(PASI > 10)和既无皮肤病也无任何明显基础疾病(如代谢综合征、肠道疾病和癌症的健康人。在研究前14天内，没有参与者使用益生菌、全身抗生素或类固醇。所有参与者都提供了书面知情同意书，以公布其病例详情。该研究获得厦门长庚医院伦理委员会批准。

二、EVs分离

通过一系列超速离心从血液样本中分离出血浆EVs。首先用5倍的PBS稀释4ml的血样以降低粘度，然后在4℃以2000× g离心30分钟除去碎片。将上清液转移到新试管中，并在4℃下以10000× g离心45分钟。随后使用0.45 m注射器过滤器过滤上清液，在4℃下以100000× g超速离心70分钟。将外泌体沉淀重悬于10ml冷PBS中，重复超速离心步骤。将最终的外泌体沉淀重新悬浮在100ul 0.22um过滤的PBS中，用于后续分析。

三、TEM

用负染的透射电镜观察分离的外泌体的形态。将纯化的外泌体稀释两倍至10ul的体积，并加到铜网格上1分钟，用滤纸小心除去过量的外泌体溶液。吸收的外泌体用10ul 2%乙酸铀酰染色1分钟，用滤纸除去多余的液体。网格在室温下干燥几分钟，并在80千伏下使用透射电子显微镜获取图像。

四、纳米流式（nanoFCM）检测

使用纳米流式检测仪（N30E，NanoFCM，中国厦门）分析血清外泌体的浓度和大小。使用200nm二氧化硅纳米球混合物来校准分离的血清外泌体的浓度和大小。使用冷PBS (1:4稀释比)稀释每个样品（20ul），随后，用20ul FITC小鼠抗人CD9和FITC小鼠抗人CD81抗体(BD Biosciences)在37℃染色30分钟。同型对照作为阴性对照(BD Biosciences)。孵育后，用PBS洗涤两次，并在4℃下以110000×g离心70分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于50ul冷PBS中。上机进行检测。

五、Western Blot

使用BCA蛋白质检测试剂盒评估EVs的蛋白浓度。使用Western blotting检测EV标记物：CD9、CD63和calnexin。根据目标蛋白的分子量，将蛋白质裂解物(每孔10ug)加到10%或15%的SDS-PAGE凝胶上。将分离的蛋白质转移到甲醇活化的PVDF膜上。在室温下，将膜在含有5%脱脂奶粉的封闭缓冲液1× TBST中封闭1小时，然后在4℃下与一抗孵育过夜。过量的一抗用TBST洗涤三次来除去。接下来，将膜与二抗在室温下孵育1小时，随后在室温下用Immobilon? Western Chemiluminescent HRP Substrate 孵育5分钟，使用ChemiScope 3300 mini进行化学发光信号检测。

六、血浆EVs的DNA提取

在提取DNA之前，使用0.22um的过滤器清除EVs中的细菌和外源颗粒。EV样品100℃煮沸30分钟，再10000× g离心30分钟。DNA的质量和数量用 NanoDrop测定。用1%琼脂糖凝胶确定DNA浓度和纯度。

七、文库制备和测序

所有PCR反应均采用TransStart?FastPfu DNA Polymerase（TransGen Biotech）。对于全长16S rRNA基因测序，根据16S宏基因组测序文库制备程序（Pacific Biosciences）使用了一套特异性引物(27F：5'-CCTACGGGNGGCWCAG-3'，1492R：5'-GACTACHVGGGTAT CTAATCC-3')。PCR反应产物混合物用2%琼脂糖凝胶电泳分离，用SYBR green loading dye染色。PCR反应产物用QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)纯化。测序文库用SMRTbell Template Prep Kit （Pacific Biosciences）生成。文库的质量用 Qubit 4.0 fluorometer (Thermo Scientific）和Femto Pulse system (Agilent）进行评估。最后，在PacBio测序平台上对该文库进行了测序。

八、 微生物图谱的处理和分析

使用SMRT Link软件，在PacBio的官方流程中，循环一致性序列(CCS)读数的最小预测精度为0.9，最小通过次数设置为3。多路分解后，用DADA2(版本1.10.1)进一步处理CCS读数，以获得单核苷酸分辨率的扩增子。DADA2工作流程包括质量筛选、去重复、学习数据集特定的误差模型、扩增子序列变异(ASV)推断和嵌合体去除。对于每一个代表性序列，QIIME2中的特征分类器和classifyconsensus-blast算法被用来基于从NCBI数据库中检索到的信息来注释分类。

为了分析不同ASVs之间的序列相似性，使用QIIME2比对MAFFT对照NCBI数据库进行了多序列比对。主坐标分析(PCoA)是使用距离矩阵来获取主坐标，以可视化复杂的多维数据。LEfSe将LDA应用于被鉴定为显著不同的细菌分类群，并进一步评估每个差异丰富分类群的效应大小。在这项研究中，LDA评分(log 10) > 4的分类群被认为是显著的。对于功能分析，使用PICRUSt (v1.1.1)分析了来自16S rRNA测序数据的功能丰度，以预测功能基因。

结果展示：

一、EVs的分离和鉴定

图1. A. EVs电镜照片；B. 纳米流式（nanoFCM）测定EVs粒径分布和 C. 浓度；D. 纳米流式（nanoFCM）检测EVs标志物CD9和CD81的表达量，以及对应的同型对照作为阴性对照；E. Western blot检测CD9, CD63和calnexin表达水平。

二、 健康人和银屑病患者不同微生物群的差异

图2. 健康人和银屑病患者血浆细菌群落的α多样性指标。

三、 优势菌在不同染色体水平上的分布

图3. 健康人和银屑病患者不同微生物群中的β-多样性。

图4. 前10种相对丰度分布

四、健康人和银屑病患者微生物群组成的差异分析

图5. 两组间物种多样性分析。

结果就展示这么多，有兴趣的话可以自己找这篇文献具体看，或者私聊我要文献资料，有理解得不对的地方，欢迎专业人士指正，一起交流~

参考文献：

[1]Chang, CJ; Zhang, J; Tsai, YL; et al.Compositional Features of Distinct Microbiota Base on Serum Extracellular Vesicle Metagenomics Analysis in Moderate to Severe Psoriasis Patients.[J].Cells.2021,10(9):

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