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【调剂】北京石油化工学院2024年16个专业接受调剂
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Sily2020

新虫 (小有名气)

[求助] 求助帖:质粒提取摇菌失败求助已有1人参与

新手第一次做质粒转化,挑菌、提取,做的是PNL-4-3这个质粒,转化使用热激法,质粒+感受态细胞stbl3结合冰浴30min,热激90s,在冰浴2min,加1ml的无抗LB培养基,摇1h,取10ml菌液铺固体培养基,虽然长菌挺密,但可挑出单菌落,然后10ml有抗培养基摇菌,摇了20管,过夜摇菌,浑浊了,然后用天根大抽提试剂盒,富集了将近200ml的菌体,严格按照说明书做,但最后提取出的质粒浓度不到50ng/ul,纯度OD260/280大于2,为什么呢?希望各位虫友解答一下,感谢

求助帖:质粒提取摇菌失败求助


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snoopyzxx

木虫 (著名写手)

挑克隆后先用5毫升摇菌,保种一毫升。剩下的四毫升提取质粒电泳鉴定。不要一来就大抽。小的证明没问题再大抽。

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生物资源交流QQ群:1044518333
3楼2021-01-22 13:07:47
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wshdhr8

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by Sily2020 at 2021-01-23 15:19:00
那我是先用试管摇10ml,浑浊后,抽5ml,放锥形瓶摇100ml,可以吗
...

还有,试剂盒的洗涤buff要加无水乙醇的

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10楼2021-01-23 18:35:08
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普通回帖

wshdhr8

铁虫 (小有名气)

菌液摇的不够浑,试管摇不开,用锥形瓶

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2楼2021-01-22 11:29:26
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)

还有涂平板,如果是质粒转化,涂100-200微升菌夜就够了。你10毫升怎么涂的?

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生物资源交流QQ群:1044518333
4楼2021-01-22 13:08:51
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ppppzj5201

铁虫 (小有名气)

同意某楼,1mL LB复苏培养后离心弃900微升,剩余的重悬菌体沉淀涂板,你的为什么是10mL
5楼2021-01-22 14:50:32
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Sily2020

新虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by snoopyzxx at 2021-01-22 13:07:47
挑克隆后先用5毫升摇菌,保种一毫升。剩下的四毫升提取质粒电泳鉴定。不要一来就大抽。小的证明没问题再大抽。

我们实验室没有做质粒电泳的机器,所以没法验证,只能大提

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6楼2021-01-23 15:15:08
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Sily2020

新虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by snoopyzxx at 2021-01-22 13:08:51
还有涂平板,如果是质粒转化,涂100-200微升菌夜就够了。你10毫升怎么涂的?

说错了,我用的是10ul涂板的,之前用的是100-200但每次都长满培养皿了

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7楼2021-01-23 15:15:59
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Sily2020

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by wshdhr8 at 2021-01-22 11:29:26
菌液摇的不够浑,试管摇不开,用锥形瓶

那我是先用试管摇10ml,浑浊后,抽5ml,放锥形瓶摇100ml,可以吗

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8楼2021-01-23 15:19:00
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wshdhr8

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by Sily2020 at 2021-01-23 15:19:00
那我是先用试管摇10ml,浑浊后,抽5ml,放锥形瓶摇100ml,可以吗
...

挑斑可以直接加到锥形瓶里摇培,过夜能摇浑。你说的先用试管活化一下,试管太细,加的LB不宜太多,2-3-4毫升这个水平,白天摇几个小时微浑,然后1:500   1:1000加到锥形瓶里过夜都行,只要方法对了,都能做出来。

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9楼2021-01-23 18:33:22
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