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ylian0

木虫 (小有名气)


[交流] qPCR标曲正常,但是结果比理论值高1~2个数量级,求大家帮忙分析原因。

大家好,我这边最近做qPCR绝对定量遇到一个现象,就是qPCR的结果和我的菌液镜检结果相差1~2个数量级,下面把结果和实验中的一些参数给大家看看,请帮忙分析一下。
我的qPCR结果显示我菌液浓度约为8E+11copies/ml,显微镜检结果约为3E+9个/ml。
由于不确定细菌基因拷贝数,假如拷贝数为10,qPCR的结果仍然是8E+10 cell/ml,还是比显微镜检高了1个数量级。
虽然显微镜检也是相对定量,结果有与实际值有偏差,但是10倍差在显微镜下差异还是很大的。

我是提取的质粒DNA,用qubit测的浓度为84ng/μl,目的片段碱基数分别为A:T:C:G=59:50:73:95(合计277),质粒用的pMD-19T碱基数A:T:C:G=662::69:676:686(合计2693),计算公式为:标品拷贝数=84x(6.02E+23)/(277+2693)/660,质粒标品浓度为2.58E+10 copies/μl,质粒进行10倍梯度稀释取2~8次方进行qPCR检测。

标准曲线参数:扩增效率90.6%,R2=0.999,slope=-3.571
溶剂曲线:单峰,无非特异性扩增

样品DNA稀释100倍进行qPCR检测,下机拷贝数为:1.56E+7 copies/μl
用0.2ml菌液离心洗涤,400μl重悬破壁后取上清200μl提DNA,50μl去离子水洗脱,
DNA拷贝数计算公式为:菌液DNA含量(copies/ml)=(1.56E+7)x100x50x2/0.2,结果约为8E+11copies/ml

小木虫今天没法上传图片,只能辛苦大家看文字版了,谢谢!
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junjieshao

禁虫 (小有名气)


ylian0(金币+1): 谢谢参与
本帖内容被屏蔽

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4楼2020-11-20 23:44:04
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mariahit

新虫 (初入文坛)



ylian0(金币+1): 谢谢参与
引用回帖:
1楼: Originally posted by ylian0 at 2020-11-20 15:50:28
大家好,我这边最近做qPCR绝对定量遇到一个现象,就是qPCR的结果和我的菌液镜检结果相差1~2个数量级,下面把结果和实验中的一些参数给大家看看,请帮忙分析一下。
我的qPCR结果显示我菌液浓度约为8E+11copies/ml, ...

最后没明白为什么要乘以二,而且感觉应该跟质粒的拷贝数进行比较吧,qpcr首次接触,只是个人观点

发自小木虫Android客户端
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14楼2020-11-21 23:47:01
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Taqman-

新虫 (初入文坛)



ylian0(金币+1): 谢谢参与
(≧ω≦)/

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17楼2020-11-22 22:44:59
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ylian0

木虫 (小有名气)


引用回帖:
14楼: Originally posted by mariahit at 2020-11-21 23:47:01
最后没明白为什么要乘以二,而且感觉应该跟质粒的拷贝数进行比较吧,qpcr首次接触,只是个人观点
...

乘以2是因为在提DNA的过程中,只取了混合菌液一半的液体进行提DNA操作,我们用的beads破壁,不是所有重悬菌液都能用于提DNA。
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25楼2020-11-26 09:21:41
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tzynew2楼
2020-11-20 17:36   回复  
ylian0(金币+1): 谢谢参与
2020-11-20 21:53   回复  
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icanspll5楼
2020-11-21 14:01   回复  
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zzhello6楼
2020-11-21 14:01   回复  
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yaqianye7楼
2020-11-21 14:01   回复  
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2020-11-21 14:01   回复  
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2020-11-21 14:02   回复  
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Haibo_10楼
2020-11-21 14:04   回复  
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howtoge11楼
2020-11-21 14:05   回复  
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shehuifei12楼
2020-11-21 14:05   回复  
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gofast11213楼
2020-11-21 14:11   回复  
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2020-11-22 08:17   回复  
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2020-11-22 08:18   回复  
nono200918楼
2020-11-23 07:07   回复  
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2020-11-23 15:19   回复  
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psylhh20楼
2020-11-23 22:44   回复  
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syhorchid21楼
2020-11-23 23:12   回复  
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2020-11-24 14:10   回复  
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2020-11-24 16:44   回复  
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2020-11-24 20:41   回复  
BiotageAB26楼
2020-12-01 10:39   回复  
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