| 查看: 781 | 回复: 3 | ||
| 【悬赏金币】回答本帖问题，作者XM沐沐将赠送您 10 个金币 | ||
XM沐沐新虫 (小有名气)
|
[求助]
关于质粒重组，请教大佬们~已有2人参与
|
|
| 合成的引物，退火用klenow fragment补齐，酶切后用T4连接酶插入到相同酶切的质粒中，通过DH5α转化，没有菌落长出，是什么问题啊？是质粒重组没有连接上么？ |
回复此楼» 猜你喜欢
负载率计算
已经有0人回复
-
球磨纳米粒子条件
已经有6人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有277人回复
-
球磨分散剂
已经有4人回复
-
阴阳离子交换剂！！！！
已经有3人回复
-
二苄基磷酰氯，磷酸接酚羟基，
已经有8人回复
-
二苄基磷酰氯，磷酰氯
已经有9人回复
-
酸酐或者羧酸酰氯化
已经有15人回复
雨独步
铁杆木虫 (正式写手)
- 应助: 97 (初中生)
- 金币: 6711.3
- 散金: 349
- 红花: 10
- 帖子: 933
- 在线: 419.2小时
- 虫号: 1333812
- 注册: 2011-06-29
- 性别: GG
- 专业: 生物化学
2楼2020-01-16 13:03:42
liling0601
铜虫 (小有名气)
- 应助: 3 (幼儿园)
- 金币: 307.2
- 散金: 34
- 帖子: 148
- 在线: 62.8小时
- 虫号: 2661775
- 注册: 2013-09-17
- 性别: MM
- 专业: 生物大分子结构与功能
3楼2020-01-17 13:32:24
原海亮
木虫 (著名写手)
- 应助: 232 (大学生)
- 金币: 4607.4
- 散金: 3521
- 红花: 33
- 帖子: 1804
- 在线: 375小时
- 虫号: 1392705
- 注册: 2011-09-06
- 性别: GG
- 专业: 微生物生理与生物化学
【答案】应助回帖
|
导致没有菌生长的原因有很多，比如，片段酶切处理不完全、载体处理不完全、连接效率过低、感受态细胞效率低下等等。如果想找到原因还是建议做一些对照实验，比如可以用空载转感受态，验证感受态细胞效率，通过载体自连转化验证载体处理效果等。 大家经常面对的是假阳性比较多，即载体自连。对于楼主出现的连一个菌都不长的情况，首先确定平板抗性正确，然后使用空载体进行转化，验证感受态细胞的效率，当然如果感受态细胞其他人用着可以，那就不用做该对照。 不太清楚楼主的实验目的，描述的比较简单，且“合成的引物，退火用klenow fragment补齐”是pcr扩增基因产物？我没做过，所以不太清楚表达的意思。 其实转化的主要因素就是：片段、载体、连接体系 pcr片段进行酶切时候，最容易出现酶切不完全的情况，因为切下来的碱基少，电泳无法分辨。可以考虑连接T载体后，提取质粒进行酶切，这样可以通过电泳检测片段是否酶切完全。 载体也同样存在酶切是否完全的问题，特别双酶切的时候，很多判断是否两个酶都酶切完全。这时候我们一般会适当的增加酶量和时间，但这一般不会导致一个菌都不长，会出现载体自连情况。 接下来就是连接，我建议在进行片段和载体连接前，一定进行电泳检测你的片段和载体浓度，因为我们之前就出现过，对片段载体胶回收后进行连接效率很低，后来发现回收的片段浓度电泳都看不到，所以根据经验，还是做个电泳检测，如果片段浓度可以，那就尽量多的加入片段，载体有一点即可，可以增加转化子的阳性数。 |
4楼2020-04-08 14:26:18
5