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小龙基因新虫 (正式写手)
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[求助]
解淀粉芽孢杆菌转化求助
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解淀粉芽孢杆菌转化求助。按文献常见的解淀粉、枯草及地衣芽孢转化的方法进行尝试，均未成功，希望有成功经验的前辈指点一二，若成功，2000金币答谢。以下是做了较多尝试的电转化法，也更换过NCM或2XYT培养基及电击仪，并尝试过化转，原生质体转化及BamHI甲基化处理，均未成功，暂且不罗列，欢迎交流和指导。 实验试剂： GM:LB+0.5M 山梨醇 ETM:0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10%甘油 RM：LB+0.5M山梨醇+0.38甘露醇 方法： 1）新鲜平板挑单菌落（小一点为好）接种于5mlLB培养基中，过夜培养.。 2）2%或4%。培养基为50mlGM。37℃，200rpm培养至OD600=0.6-0.8,或0.85-0.95（大约3-4小时）左右，（试过加0.2-2%的甘氨酸后继续摇1h，但发现加0.5%的甘氨酸后菌浓度明显下降，可能是细胞壁弱化后导致的菌体自溶）。 3）取全部菌液冰水浴10 min，然后8000rpm，8min，4℃离心收集菌体。 4）用20ml预冷的电转缓冲液ETM洗涤菌体，8000rpm，8min，4℃离心去上清，如此漂洗4次。 5）将洗涤后的菌体重悬于等500μl的ETM中，每管分装60μl. 6）将60μl感受态细胞中加入2-10 μl质粒，冰浴孵育5min，加入预冷的电转杯（1mm）中，电击一次。电转仪设置：2.1kv，25μF200Ω，1mm,电击1次. （持续时间4.5ms-5ms之间） 7）电击完毕立即加入1ml 复苏培养基RM，37℃，200rpm，复苏3h后，涂板。37℃，过夜培养 电压做过0.75~2.5KV，但是转化后涂板就是什么都不长，求大神们指教一二！@天使托 |
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