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【调剂】北京石油化工学院2024年16个专业接受调剂
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zhuzhu1995

新虫 (初入文坛)

[交流] LR反应，测序总是不对，表达载体构建反复失败，这是为什么？

各位大神大家好， 微生物菜鸟一枚。最近在LR这失败了两个月， 都没有找到原因，

我的入门载体是PGWC，已连接好我的CDS进行了测序，现在我通过gateway技术将我的基因从入门载体LR到表达载体

送测序了大概7.8次，我有6个表达载体都需要构建

测序结果 ：   头两次是测序公司打电话说细胞壁没办法裂解，没法提质粒，我自己从过去质粒他说我质粒无信号，我用自己克基因引物测的
                     后来又送了两批，送的菌液，结果是测序失败。我自己提质粒 这边我就提不出来了 测序公司打电话说怀疑是污染，用自己克基因引物测的
                    用了别人提的表达载体质粒 又送过去了一波，测序成功了 相似度百分之20多，不是我的东西， 用PGWB表达载体通用引物测序的
                    我又用了买的DH5感受态，又送过去了一波， 测序显示有重叠峰，我把测序结果到NCBI上比对了一下，发现是我的表达载体的序列。

现在不知道怎么办了 ，等着载体成功后转农杆菌呢，这重复无意义的工作，还没有找到原因。烟草都种了好几批了，请问问题出在哪，我应该怎么办

跪谢
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1楼2018-07-23 19:50:07
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yangang18

禁虫 (初入文坛)
本帖内容被屏蔽
2楼2018-10-28 13:55:40
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凌儿凌夷

铜虫 (小有名气)
合成一个质粒，然后再自己酶切，链接吧，这样太浪费时间了，还花钱
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3楼2018-11-01 08:06:56
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好运连连OK

新虫 (小有名气)
前面两次你都是用你自己的特异性引物进行测序的，无信号的话就证明是空载了，后面是你的表达载体序列那么还是空载，或者你的载体改造过，建议你先做个TA克隆看下

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4楼2018-11-01 10:32:08
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蝶恋花5280

铁虫 (小有名气)
gateway那个重组酶太傲娇了，有时候只是在冰上几分钟就失去活性，我以前也和你一样总是连不上。后来就找别的课题组要了2uL酶居然就连上了。时间还是耽误不少啊，用gateway技术本来就图它构建载体快，可是我自认为得不偿失啊。而且pGWB5这个载体左右边界中间的一段有10kbp太大了，插入烟草基因组的片段越大越难转化，而且还有一个GFP蛋白，如果你们组没有相应做蛋白的技术的话，基本上没用，也就只能等转基因烟草出来了，在荧光显微镜下看看根里面有没有GFP
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5楼2018-11-05 16:22:15
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wswshuai_ccl

银虫 (小有名气)
你做了第一步BP反应吗？  BP阳性的话，LR怎么做都能成功的啊。  质粒还是要自己提出来，做了酶切再送测序啊。
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6楼2018-11-08 01:01:23
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wx12355

新虫 (初入文坛)
你好楼主你的问题解决了吗？我有两个基因，一个LR反应成功了，一个几次了都不成功，酶太贵了又不好跟老师说，找不到问题，我看测序结果了，BP接头也加上了的，两个基因我自己一起没做出来，换了师妹做，一个就成功了，一个怎么都不成功，现在不知道是不是酶的原因了，隔了一天就做不出来，很烦，看你的这是新帖，希望以后有经验一起分享，实验室就我一个人在做这个
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7楼2018-11-20 20:17:05
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wx12355

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 好运连连OK at 2018-11-01 10:32:08
前面两次你都是用你自己的特异性引物进行测序的，无信号的话就证明是空载了，后面是你的表达载体序列那么还是空载，或者你的载体改造过，建议你先做个TA克隆看下

我的入门载体是PDONR221，表达载体是PGW551，这个如果要酶切验证的话，怎么验证？用什么酶酶切
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8楼2018-11-20 20:22:54
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