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荧光标记方法有这4种，小伙伴们知道吗？已有2人参与
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实时荧光定量PCR（real-time,quantitative PCR）技术是在PCR技术基础上发展起来的一种高度灵敏的新型核酸定量检测、分析技术。它通过在PCR扩增反应过程中加入荧光物质，使得对反应过程的实时监控成为可能。它具有实时监测、定量准确、灵敏度高、反应速度快、重复性好及反应后不需电泳检测等优点，已逐步成为分子生物学研究中的重要工具。 目前，Real-time Q-PCR所使用的荧光化学方法主要有四种，也主要有四种方法可用于DNA扩增产物的检测，这些方法有着相近的灵敏度。分别是DNA结合染料法、水解探针法、杂交探针法、荧光引物法。 1. SYBR green I染料 反应体系中，加入过量SYBR 荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的扩增完全同步。其优点是对模板没有选择性，使用方便，非常方便，但也易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性，可以通过溶解曲线的分析，优化反应条件。 2. Taqman 探针 目前在Real-time Q-PCR中最广泛使用的Tagman系统就是运用了这个原理。它能被DNA合成酶（例如Taq酶）的5'-3'活性所降解，探针的5'端有一荧光报告基团，3'端有一荧光淬灭基团，当两个基团相互先靠近的时候，由于发生能量传递作用，报告基团不能发出荧光，但随着扩增反应的进行，5'端得报告基团随着探针的水解而脱落下来，不再与淬灭发生能量传递作用，从而能发出荧光，被信号探测器所捕获。 3. Scorpions 它由两个寡核苷酸分子组成，一个是引物，另一个是带荧光分子的探针，但是此探针也具有引物的功能。引物与形成发夹结构的探针相连，在探针上由于荧光报告基团与淬灭基团相互靠近，不发荧光。变性阶段，探针的发夹结构会解开，在退火时则与模板相结合，形成线性分子，报告基团同淬灭基团分离而发射荧光。在探针的设计上，要求绝对保守，长度为25-32bp，Tm在68-70度之间，探针的5'端不能为G，避免多个碱基同时出现，尤其要避免4个G同时出现，另外，探针应靠近上游引物。 4. 分子信标 分子信标是（Molecular beacon）是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，因此标记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近。荧光基团被激发后产生的光子被淬灭剂淬灭，由荧光基团产生的能量以红外光而不是可见光形式释放出来。在复性温度下，因为模板不存在时形成茎环结构。当加热变性会互补配对的茎环双链解开，如果有模板存在环序列将与模板配对。与模板配对后，分子信标将成链状而非发夹装，使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，淬灭作用被解除，发出激光分子。 |
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