【调剂】北京石油化工学院2024年16个专业接受调剂
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Korea??

新虫 (正式写手)

[交流] 总RNA提取,还是不干净,求助已有15人参与

今天提取RNA,尽管已经很小心,但是还是不干净。是蛋白质污染还是DNA污染呢?第一张彩图是RNA电泳第二个样品的25S、18S和5S算可以分清了,可是合成cDNA后做PCR,还是什么都没PC出来,我用RNA也一起做了PCR,没P出条带,是不是说明没有DNA污染呢?谁来救救我啊

总RNA提取,还是不干净,求助


总RNA提取,还是不干净,求助-1


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我欲乘风归去

木虫 (正式写手)

★ ★ ★
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drwhoknowss: 金币+2, 鼓励交流 2018-02-07 03:34:29
看起来像是有点降解,跑胶的时候换新鲜的电泳液,另外少加点样,再跑一次。反转录后的cDNA建议用actin引物跑一下,看能不能扩增出片段,如果actin引物都扩增不出来,说明反转录不成功。如果actin能跑出来,自己的基因跑不出来,说明扩增的基因在这个样本里的表达丰度比较低,比较难扩增。如果只是要扩增这个基因,可以把多个组织的样本混在一起提一个总RNA,再做反转录扩增试试。另外就是要注意引物设计的问题。
3楼2018-02-06 19:48:55
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GRUBBY_WU

铁杆木虫 (著名写手)

★ ★ ★
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drwhoknowss: 金币+2, 鼓励交流 2018-02-07 03:35:28
引用回帖:
5楼: Originally posted by Korea?? at 2018-02-06 21:23:03
反转录失败的根源应该就是我提的RNA不好吧?可是实验室小伙伴说,我的这个浓度和纯度也能做到P出条带的。
...

浓度和纯度能做到P出条带?!没有这种说法,能不能p出来关键不是纯度和浓度。
你测浓度和纯度用的nanodrop?如果有条件,可以跑aglient 2100或2200看看RNA的完整性和RIN值。
胶图看,RNA也还凑合,最方便的办法是先用cDNA p内参试试,actin或gapdh都可以,内参也p不出来可能是没反转没做好。如果反转没毛病,原因继续往前推。
2019更好更棒!
6楼2018-02-06 22:05:09
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渊博震天

版主 (职业作家)

Yeast Display

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4楼: Originally posted by Korea?? at 2018-02-06 21:08:36
今天才提的RNA就降解啦…………我用RNA做PCR的目的是验证是否有DNA污染,P不出来说明没有残留DNA。cDNA电泳会怎么样?
...

不是说你今天才提它就不会讲解而是在你提取过程中就发生了降解,RNA好不好跟那个比值啥的不一定是正相关关系,RNA跑电泳看着不错并且把它反转录出来那才是硬道理。

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7楼2018-02-06 22:38:59
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沐枫之城

新虫 (初入文坛)


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看图来说RNA提取的应该没问题,完全可以用来做RT-PCR的,个人感觉你的问题应该是反转没有成功,你先按照其他人说的反转扩下actin基因啥的看能不能扩出来
17楼2018-02-21 00:11:32
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渊博震天

版主 (职业作家)

Yeast Display

优秀版主优秀版主


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从第一张看RNA降解了,直接以RNA去P的话很难成功这个正常。
建议你把cDNA跑个电泳看看

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2楼2018-02-06 19:08:33
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Korea??

新虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 渊博震天 at 2018-02-06 19:08:33
从第一张看RNA降解了,直接以RNA去P的话很难成功这个正常。
建议你把cDNA跑个电泳看看

今天才提的RNA就降解啦…………我用RNA做PCR的目的是验证是否有DNA污染,P不出来说明没有残留DNA。cDNA电泳会怎么样?

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4楼2018-02-06 21:08:36
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whwei321

至尊木虫 (著名写手)

小虫


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感觉提的还可以,最有可能的原因是反转或者引物设计有问题

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坚持就是胜利
11楼2018-02-10 07:06:03
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cifer1230

金虫 (著名写手)

cifer1230


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有时候就是这样,莫名其妙的,RNA可能就提不好,但是不能只看仪器测的浓度,比值啥的,反转录下能出结果就行。

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.....
12楼2018-02-13 22:24:55
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RedBlack_m

新虫 (正式写手)


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RNA的图看起来 应该是降解了 你查一下 28s和18s的比例应该是多少就知道了。

用RNA 跑一遍PCR就知道gDNA的污染情况。

当然你也可以设计一个跨内含子的house keeping gene的primer 用你的CDNA跑一遍PCR。
15楼2018-02-14 19:43:36
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Korea??

新虫 (正式写手)

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17楼: Originally posted by 沐枫之城 at 2018-02-21 00:11:32
看图来说RNA提取的应该没问题,完全可以用来做RT-PCR的,个人感觉你的问题应该是反转没有成功,你先按照其他人说的反转扩下actin基因啥的看能不能扩出来

是的,我又重复了一遍,发现上次应该是少了一个试剂(primer).谢谢您的关注!

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18楼2018-02-21 12:28:51
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普通回帖

Korea??

新虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 我欲乘风归去 at 2018-02-06 19:48:55
看起来像是有点降解,跑胶的时候换新鲜的电泳液,另外少加点样,再跑一次。反转录后的cDNA建议用actin引物跑一下,看能不能扩增出片段,如果actin引物都扩增不出来,说明反转录不成功。如果actin能跑出来,自己的基 ...

反转录失败的根源应该就是我提的RNA不好吧?可是实验室小伙伴说,我的这个浓度和纯度也能做到P出条带的。

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5楼2018-02-06 21:23:03
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Korea??

新虫 (正式写手)

P不出来,所以在排查原因。我只是希望不是RNA的原因,.明天在做一遍,也跑一次cDNA电泳

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8楼2018-02-06 22:39:01
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Korea??

新虫 (正式写手)

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7楼: Originally posted by 渊博震天 at 2018-02-06 22:38:59
不是说你今天才提它就不会讲解而是在你提取过程中就发生了降解,RNA好不好跟那个比值啥的不一定是正相关关系,RNA跑电泳看着不错并且把它反转录出来那才是硬道理。
...

今天很仔细认真的提RNA了,还是做不好,真的好难过……………………。明天在把冷冻的RNA反转看看怎么样

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9楼2018-02-06 22:42:03
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Ivy尘

新虫 (正式写手)


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降解肯恩是两个原因:1. 样品本身保存不当,RNA降解了;2.提取过程中RNase污染
10楼2018-02-10 03:42:18
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