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qaz139687

新虫 (小有名气)

[求助] TA克隆的时候，含目的片段的质粒和不含目的片段的质粒会进入同一个感受态细胞中吗 已有3人参与

RT，菌落PCR，挑单菌落PCR发现，用M13通用引物PCR，出来2条片段，根据大小判定一个是含有目的片段的结果，一个是不含目的片段的结果，含目的片段的质粒和不含目的片段的质粒会进入同一个感受态细胞中吗
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1楼 2015-12-07 13:38:26
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FTD2015

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可以出现啊，你想如果酶切不完全，或者仅仅是单酶切，阳性质粒和重组质粒都存在，这种概率是有的。

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2楼2015-12-07 13:52:07
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qaz139687

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by FTD2015 at 2015-12-07 13:52:07
可以出现啊，你想如果酶切不完全，或者仅仅是单酶切，阳性质粒和重组质粒都存在，这种概率是有的。

关键是没酶切呢，TA克隆的时候只是质粒跟目的片段连接而已，然后在转化进入感受态细胞里面
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3楼2015-12-07 19:35:29
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生科深似海

新虫 (小有名气)
一般不会  可能是菌落没涂开 两个克隆长到一块儿了

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4楼2015-12-07 19:41:05
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zyfskj

新虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
在感受态细胞转化中，加入质粒后，适当地延长静置时间可以提高质粒的转化效率，原因是使质粒可以被感受态细胞充分吸附。在质粒转化中，经常会遇到多个质粒共转染一个细胞的情况。
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向我乞求怜悯吧，我会狠狠拒绝的。
5楼2015-12-07 19:44:58
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qaz139687

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 生科深似海 at 2015-12-07 19:41:05
一般不会  可能是菌落没涂开 两个克隆长到一块儿了

就是说一个感受态细胞一般只会进一个质粒？ 我记得以前我做菌落PCR的时候都是只有一条片段的，最近几次都是2条，不知道是不是引物被污染的原因
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6楼2015-12-08 10:38:00
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qaz139687

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by zyfskj at 2015-12-07 19:44:58
在感受态细胞转化中，加入质粒后，适当地延长静置时间可以提高质粒的转化效率，原因是使质粒可以被感受态细胞充分吸附。在质粒转化中，经常会遇到多个质粒共转染一个细胞的情况。

好吧。。请问你做过酶切吗，如果这样的话提取质粒后有2种，单酶切后有2条带，割胶回收自己的目的片段后会不会浓度很低，我需要酶切后浓度在100ng/ul，拿来合成探针用
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7楼2015-12-08 10:40:02
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享受雅雨

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
ta克隆有很多假阳性的
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8楼2015-12-08 10:48:17
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zyfskj

新虫 (著名写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by qaz139687 at 2015-12-08 10:40:02
好吧。。请问你做过酶切吗，如果这样的话提取质粒后有2种，单酶切后有2条带，割胶回收自己的目的片段后会不会浓度很低，我需要酶切后浓度在100ng/ul，拿来合成探针用...

一个转化子，这一小堆菌里提出的质粒，我觉得占主要的还是你的连上的那个,你可以将这个菌进行扩培养再提质粒那样浓度就高了对吗？一开始挑的转化子长得菌的量只是粗略让你判断是否连上了，如果你觉得连上了，就切一下，再次确认一下，或者 pcr 你的质粒是否有目的片段。只有验证成功了才会扩培酶切回收。

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向我乞求怜悯吧，我会狠狠拒绝的。
9楼2015-12-09 10:52:54
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远丽123

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by qaz139687 at 2015-12-08 10:40:02
好吧。。请问你做过酶切吗，如果这样的话提取质粒后有2种，单酶切后有2条带，割胶回收自己的目的片段后会不会浓度很低，我需要酶切后浓度在100ng/ul，拿来合成探针用...

切胶回收后浓度会低 我建议你可以用高保真的酶来扩 扩出来之后再切胶回收 再用回收的片段扩PCR 这样应该可以得到单一条带

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10楼2015-12-09 12:27:49
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