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ygy19901025木虫 (著名写手)
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The DHGD vector was constructed by first co-transfecting an ICP4, ICP27 virus with the p41ICP0LacZ plasmid containing the E. coli lacZ gene flanked by PacI sites and UL41 sequences. The lacZ reporter was then removed by PacI digestion and the digested viral DNA cotransfected with a plasmid containing the human GDNF gene and the human cytomegalavirus immediate early promoter (HCMV IEp) construct flanked by UL41 sequences. Recombinants containing the GDNF transgene in place of the lacZ reporter gene were identified from among clear plaque-producing viruses by Southern blot analysis. Control vector DHZ contained the E. coli lacZ under the control of the HCMV IEp in place of the GDNF expression cassette. A schematic of the viral constructs is shown in Fig. 1. Both of the therapeutic vectors and the control vector contain the HCMV IEp driving transgene expression. In preliminary experiments in vitro, we have found that transgene expression from this vector begins within 24h of infection, peaks at 48 to 72 h, and then declines substantially (data not shown). In vivo studies using vectors expressing neurotransmitter peptides under the control of the same promoter demonstrate the disappearance of peptide expression in vivo, measured by bioactivity, by 3 to 4 weeks after inoculation |
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至尊木虫 (知名作家)
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【答案】应助回帖
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ygy19901025: 金币+40, ★★★★★最佳答案 2015-12-01 11:08:33
ygy19901025: 金币+40, ★★★★★最佳答案 2015-12-01 11:08:33
| 胶质细胞来源的神经营养因子（GDNF）载体的构建是通过共转染含有大肠杆菌 lacZ 基因（该基因两侧分别为 PacI 位点和 UL41 顺序）的 p41ICP0LacZ 质粒和 ICP4Δ，ICP27Δ 病毒。然后通过PacI酶切去除 lacZ 报告基因，经酶切消化过的病毒 DNA 与含有人 GDNF 基因、HCMV IEp 结构，以及侧翼顺序UL41的质粒共转染。用 Southern 印迹分析在产生病毒的透明菌斑中鉴定含有转基因 GDNF （取代 LacZ 报告基因）的重组子。对照载体 DHZ 含有大肠杆菌 lacZ，其中LacZ 取代了 GDNF 表达盒，且其表达也受控于 HCMV IEp。病毒载体的构建示意图见图1。治疗载体和对照载体中都含有 HCMV IEp，控制者转基因的表达。在体外初步试验中，我们发现在转染24小时内，转基因从该载体开始表达，48之72小时达到高峰，然后大幅度下降（数据未显示）。用受控于同一启动子、表达神经递质肽的载体进行的体内研究，用生物活性测定证明，接种病毒后3到4周肽表达消失。 |
2楼2015-12-01 03:38:27
baoshanqiu
至尊木虫 (著名写手)
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ygy19901025: 金币+60, 翻译EPI+1, ★★★★★最佳答案 2015-12-01 11:08:21
ygy19901025: 金币+60, 翻译EPI+1, ★★★★★最佳答案 2015-12-01 11:08:21
| 构建DHGD载体先以含有PacI位点和UL41序列为侧翼的大肠杆菌lacZ基因的p41ICP0LacZ质粒共转染 ICP4, ICP27病毒。然后通过PacI消化去除lacZ报告基因，再将消化后的病毒DNA与含有人GDNF基因及UL41序列为侧翼的人类巨细胞病毒立即早期启动子 (HCMV IEp)质粒共转染。用 Southern blot分析产生清晰斑的病毒以鉴定含有替代lacZ报告基因的GDNF转基因重组子。对照载体DHZ含有HCMV IEp控制的大肠杆菌lacZ替代GDNF表达盒。病毒构建的简图见图1.治疗性载体和对照载体均含有HCMV IEp驱动转基因表达。通过初步体外试验，我们发现该载体转染后24小时内开始表达转基因，48到72小时达到高峰，然后大体上降低（数据未显示）。采用相同启动子控制的神经递质肽表达载体的体内研究表明，经生物活性测定，体内肽表达在接种后3到4周消失。 |
3楼2015-12-01 04:57:02