| 查看: 2101 | 回复: 3 | |||
218854055银虫 (初入文坛)
|
[求助]
救急，3RACE老是没有目前条带 已有2人参与
|
|
实验论文需要做RACE克隆全长，现在做了3’RACE就做了好久，老是做不出来。 简单说下自己试验流程：我用的是5‘/3’ RACE Kit，2 and Generation盒子。实验目的基因的片段是从基因芯片上得到了，前期做了一些预备工作，发现该序列是多基因家族。因为在设计引物的时候，发现从该片段设计出来两对引物（A3/A5、B3/B5）扩增的产物并不是完全有重叠区，本来A3/A5前面一段的序列应该全部与B3/B5尾部重叠的，但是B3/B5尾部序列和A3/A5前面序列只有一段是100%相同，后面有较大的差异，把两个片段Blast与目的基因同源性覆盖率是不同。故此认为这个基因是多家族基因（不正之处望虫友指正）。 所以我拿了和目的基因覆盖率最高，同源性最好的引物A3/A5做后面的实验。3‘RACE我用了A3(也就是RNA的正义引物)，按照盒子cDNA反转录，55℃60分钟孵化，80℃灭活。 后面用了盒子推荐的Expand High Fidelity PCR System，我的A3引物引物制作公司给的TM是64℃，CG含量56%，PCR程序自己定的：94℃ 30s，72℃ 2min，5个循环；94℃ 30s，70℃ 30s，72℃ 2min，5个循环；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 1min；72℃ 7min。（PS我是不是要按盒子推荐的程序呢？因为别人说不要按盒子程序设置）每次做结果都不一样，要么很多非特异性条带，要么片段太小，要么弥散。不知道问题出在哪？求问，急！ |
回复此楼» 猜你喜欢
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有283人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
-
氢氧化钾活化操作
已经有18人回复
-
散金
已经有67人回复
-
生物质超级电容器
已经有0人回复
humaoer00112
新虫 (正式写手)
- 应助: 2 (幼儿园)
- 金币: 216
- 散金: 773
- 红花: 3
- 帖子: 437
- 在线: 54.5小时
- 虫号: 2604146
- 注册: 2013-08-18
- 专业: 免疫生物学
2楼2015-12-27 15:28:51
sdjnyxn123
银虫 (小有名气)
- 应助: 2 (幼儿园)
- 金币: 18.8
- 帖子: 82
- 在线: 83.3小时
- 虫号: 3096694
- 注册: 2014-03-28
- 性别: GG
- 专业: 微生物资源与分类学
3楼2015-12-27 17:50:20
4楼2016-04-01 22:31:26
40