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银虫 (初入文坛)

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专业: 植物病理学

[求助] 救急，3RACE老是没有目前条带已有2人参与

实验论文需要做RACE克隆全长，现在做了3’RACE就做了好久，老是做不出来。
简单说下自己试验流程：我用的是5‘/3’ RACE Kit，2 and Generation盒子。实验目的基因的片段是从基因芯片上得到了，前期做了一些预备工作，发现该序列是多基因家族。因为在设计引物的时候，发现从该片段设计出来两对引物（A3/A5、B3/B5）扩增的产物并不是完全有重叠区，本来A3/A5前面一段的序列应该全部与B3/B5尾部重叠的，但是B3/B5尾部序列和A3/A5前面序列只有一段是100%相同，后面有较大的差异，把两个片段Blast与目的基因同源性覆盖率是不同。故此认为这个基因是多家族基因（不正之处望虫友指正）。
所以我拿了和目的基因覆盖率最高，同源性最好的引物A3/A5做后面的实验。3‘RACE我用了A3(也就是RNA的正义引物)，按照盒子cDNA反转录，55℃60分钟孵化，80℃灭活。
后面用了盒子推荐的Expand High Fidelity PCR System，我的A3引物引物制作公司给的TM是64℃，CG含量56%，PCR程序自己定的：94℃ 30s，72℃ 2min，5个循环；94℃ 30s，70℃ 30s，72℃ 2min，5个循环；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 1min；72℃ 7min。（PS我是不是要按盒子推荐的程序呢？因为别人说不要按盒子程序设置）每次做结果都不一样，要么很多非特异性条带，要么片段太小，要么弥散。不知道问题出在哪？求问，急！

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