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新虫 (小有名气)

[求助] 菌液测序结果全是非单克隆,求助分析已有2人参与

最近同时做了两个植物内生真菌基因库的TA克隆(简称M和N吧),用的18t载,蓝白斑筛选后,后送公司测序。
     第一天M送了十几个样,除了部分公司说没有培养成功,无法提取质粒外,其他的基本都测序成功,且测出来的目的基因序列没有问题。
     第二天N送了15个样,公司说5个培养失败,2个测序失败,7个非单克隆,1个测序成功,但是这个测序成功的序列我去载体后的基因序列压根不是我想要的。
     然后我对7个非单克隆的序列尝试去载体,有几个序列能找到插入点前端序列,但是找不到插入点后端序列;还有的插入点前后端序列都找不到;还有的前后端序列都能找到,但插入的序列不是目的序列。
     同一批的处理,出现这种结果,不是很理解,我在送样前每个都随机筛选了七八个样,跑了菌液pcr,看了条带,都没有问题。本人小白,也是刚刚接触克隆测序实验,还请大家多多指教。

以下为几张测序显示非单克隆的峰图:

菌液测序结果全是非单克隆,求助分析
截图00.jpg


菌液测序结果全是非单克隆,求助分析-1
截图01.jpg


菌液测序结果全是非单克隆,求助分析-2
截图02.jpg
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wcq吴超群

新虫 (小有名气)

2楼2015-11-22 20:31:24
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wcq吴超群

新虫 (小有名气)

3楼2015-11-22 21:52:08
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51mimi

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
分析两次有什么差别,会有帮助。

发自小木虫Android客户端
4楼2015-11-23 09:14:26
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lvshilu

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
"然后我对7个非单克隆的序列尝试去载体,有几个序列能找到插入点前端序列,但是找不到插入点后端序列;还有的插入点前后端序列都找不到;还有的前后端序列都能找到,但插入的序列不是目的序列"这段话我没太看懂,是不是就是没有找到插入目的序列的意思?

菌p的引物不能用pcr特异性引物,会有假阳性,用质粒的测序引物,比如M13来菌p试试,如果拿不到目的条带,就说明你没将目的序列连入质粒。
需要金币
5楼2015-11-23 09:34:35
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wcq吴超群

新虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by lvshilu at 2015-11-23 09:34:35
"然后我对7个非单克隆的序列尝试去载体,有几个序列能找到插入点前端序列,但是找不到插入点后端序列;还有的插入点前后端序列都找不到;还有的前后端序列都能找到,但插入的序列不是目的序列"这段话我没 ...

嗯,我跑pcr用的就是M13引物对跑的pcr,我说的意思是测出来的序列里面也没有载体插入点序列,不知道怎么测出来的序列

发自小木虫Android客户端
6楼2015-11-23 22:45:37
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璎珞流苏169

银虫 (初入文坛)

请问楼主解决了这个非单克隆问题吗
7楼2016-03-07 09:21:18
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橡胶手套

新虫 (初入文坛)

我也遇到了非单克隆,请问你怎么解决的呢?
8楼2017-05-05 10:34:54
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